ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 426, № 3, с. 406-409
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576.32/36.577.4
ЭКЗОГЕННЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА БТШ70 ПОДАВЛЯЮТ ЭНДОТОКСИН-ИНДУЦИРОВАННУЮ АКТИВАЦИЮ
НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2009 г. М. М. Юринская, М. Г. Винокуров, О. Г. Зацепина, Д. Г. Гарбуз, И. В. Гужова, Е. А. Рожкова, А. В. Сусликов, В. Л. Карпов, М. Б. Евгеньев
Представлено академиком Ю.В. Ильиным 07.10.2008 г. Поступило 15.10.2008 г.
В медицине до сих пор нет надежных средств от эндотоксин-индуцируемого сепсиса. В настоящей работе на модели человеческих нейтрофи-лов показано, что белки теплового шока с молекулярной массой 70 килодальтон (БТШ70) разного происхождения имеет достоверное защитное действие при бактериальном сепсисе.
В механизме развития сепсиса и эндотоксино-вого шока, вызванного грамотрицательными бактериями, важную роль играют миелоидные клетки крови, участвующие в регуляции механизмов врожденного иммунитета. Активатором патологических процессов в организме человека при сепсисе являются компоненты клеточной стенки грам-отрицательных бактерий - липополисахариды (LPS, эндотоксины) [1]. В распознавании липопо-лисахаридов участвуют специфические рецепторы клеток-мишеней, такие как CD14, P-2-интегрины (CD11/CD18), которые совместно с ТоП-like рецептором и другими белками и рецепторами образуют рецепторный комплекс при активации клеток-мишеней эндотоксинами [2]. В патогенезе воспалительных заболеваний (в том числе и сепсиса) ключевая роль принадлежит нейтрофилам. LPS вызывают активацию нейтрофилов (увеличивают продукцию активных форм кислорода и экспрессию P-2-интегринов [3]) и увеличивают продолжительность жизни циркулирующих в кровяном русле этих клеток, ингибируя их апо-птоз. Ингибирование апоптоза нейтрофилов является одной из причин неэффективного клирен-
Институт биофизики клетки
Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгелъгардта
Российской Академии наук, Москва
Институт цитологии
Российской Академии наук, Санкт-Петербург Болъница Пущинского научного центра Российской Академии наук, Московская обл.
са этих клеток из тканей и вследствие этого повреждения тканей при воспалении. В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции ряда воспалительных заболеваний, в том числе и сепсиса [4]. При воспалительных заболеваниях наблюдается увеличение экспрессии белков теплового шока. Эндотоксины увеличивают синтез и накопление БТШ в различных миелоидных клетках, в частности БТШ70, играющего важную роль в механизмах защиты организма от теплового и других видов стресса [5]. В последнее время было показано, что экзогенный БТШ70 оказывает защитное действие на клеточные культуры [6] и увеличивает выживаемость животных в модели эндотокси-нового шока [7]. БТШ70 также участвует в механизме толерантности к эндотоксинам миелоид-ных клеток [8]. Ранее была показана необычная регуляция синтеза БТШ70 в ответ на повышение температуры в клетках крови верблюда, который является одним из самых терморезистентных животных на Земле [9]. Было интересно сравнить действие БТШ70, выделенного из сердечной мышцы верблюда, с действием эндогенного ре-комбинантного человеческого БТШ70, нарабатываемого в экспрессионной системе в клетках шелкопряда.
Цель настоящей работы - исследование действия экзогенных белков теплового шока БТШ70 (рекомбинантного и верблюжьего) на активацию и апоптоз нейтрофилов при действии эндотоксина E. coli (LPS).
В работе использовали следующие вещества: среда RPMI-1640, эмбриональная телячья сыворотка, иодид пропидия (ИП), HEPES, раствор Хенкса, пенициллин, стрептомицин, дигитонин, фиколл 400, фосфатный буфер, формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), липополисахарид (LPS) из линии E. coli O111:B4, полимиксин B ("Sigma", США). Hoechst 33258 ("Calbiochem", США).
Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-слой-ном градиенте фиколла-верографина (1.119 и 1.077). Жизнеспособность нейтрофилов контролировали методом проточной цитофлуоримет-рии с использованием ИП [10]. Жизнеспособность выделенных клеток составляла 98-99%.
Праймирование нейтрофилов проводили по [10] с некоторыми модификациями. Нейтрофилы в растворе Хенкса (1 ■ 106 клеток/мл) были прай-мированы 20 нг/мл LPS в течение 30 мин при 37°С в присутствии 2% плазмы (пул плазмы 10 здоровых доноров хранился перед использованием при -70°С). Образцы помещали в люминометр 1250 ("LKB", Швеция). Клетки были стимулированы с 1 мкМ fMLP в присутствии 35 мкМ люми-нола. Хемилюминесценцию (ХЛ) регистрировали в течение 10 мин. Данные анализировали с помощью программы SigmaPlot.
Для изучения уровня экспрессии клеточных рецепторов CD11b/CD18 на поверхности нейтрофилов применяли метод проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональ-ных антител (анти-CDHb), конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом ("Caltag", США).
При исследовании апоптоза выделенные нейтрофилы (106 клеток/мл) культивировали в среде, содержащей RPMI-1640, 1% L-глутамина, 1% пенициллина, 1% стрептомицина и 10% термоинакти-вированной эмбриональной сыворотки при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 14 ч.
Апоптоз регистрировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием 1 мкг/мл флуоресцентного зонда Hoechst-33258 [10]. Жизнеспособность нейтрофилов после окончания культивирования составляла 96-98%.
Верблюжий БТШ70 выделяли по ранее описанной методике [9], а ген рекомбинантного человеческого белка БТШ70 был клонирован для дальнейшей экспрессии под полиэдриновым промотором в бакмиду, как описано в [11]. Рекомби-нантный белок, экспрессированный в клетках шелкопряда (Spodoptera), очищали на Ni-NTA-ко-лонках согласно рекомендациям производителя ("QUIAGEN").
В первой серии экспериментов мы проанализировали действие рекомбинантного "рекБТШ70" и верблюжьего "вБТШ70" белков теплового шока на продукцию активных форм кислорода, генерируемых нейтрофилами в ответ на действие fMLP (рис. 1). Инкубирование нейтрофилов с LPS (30 мин) значительно увеличивало величину ХЛ клеток по сравнению с контролем (рис. 1, 1). Рек-БТШ70 несколько увеличивал продукцию активных форм кислорода нейтрофилами (рис. 1, 2а) по сравнению с вБТШ70 (рис. 1, 3а) и контрольными нейтрофилами (рис. 1, 1а). Значения ХЛ нейтро-
ХЛ, %
180 г
160 140 120 100 80 60
Е^Э б
е^З в
I
1
3
Рис. 1. Действие БТШ70 на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами. 1 - контрольные клетки; 2 - рекомбинантный БТШ70 (1 мкг/мл); 3 -верблюжий БТШ70 (1 мкг/мл). а - без LPS, б - в присутствии LPS (20 нг/мл); в - в присутствии полимикси-на B (20 мкг/мл).
филов в присутствии исследованных БТШ70 и по-лимиксина В практически не отличались от ХЛ контрольных клеток (рис. 1). Предварительное инкубирование нейтрофилов в течение 5 мин с БТШ70 (перед добавлением LPS) значительно снижало величину ХЛ клеток по сравнению с активацией в присутствии только LPS (рис. 1, 26,36). При этом вБТШ70 оказывал практически полный защитный эффект по сравнению с рекБТШ70.
Во второй серии экспериментов было исследовано действие рекБТШ70 и вБТШ70 на экспрессию CD11b/CD18-рецепторов нейтрофилов при действии эндотоксинов. Эти белки незначительно увеличивали экспрессию исследованных рецепторов (рис. 2, 2а, 3а). Предварительное инкубирование нейтрофилов с 1 мкг/мл БТШ70 в течение
5 мин снижало эндотоксин-индуцированное увеличение экспрессии CD 11b/CD 18-рецепторов нейтрофилов (рис. 2, 26,36).
В третьей серии экспериментов было исследовано действие рекБТШ70 и вБТШ70 на апоптоз нейтрофилов в присутствии эндотоксина. 100 нг/мл LPS ингибировали апоптоз контрольных нейтрофилов (принят за 100%) на 35%, что хорошо согласуется с данными работы [10]. Оба использованных препарата БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл незначительно ингибировали апоптоз нейтрофилов (рис. 3, 16и 36; 1в и 3в). Предварительное инкубирование нейтрофилов (в концентрации 0.1 и 1 мкг/мл) рекБТШ70 оказывало небольшой защитный эффект на эндотоксин-индуцированное ингибирова-ние апоптоза нейтрофилов (рис. 3, 26,46). вБТШ70
408
ЮРИНСКАЯ и др.
Флуоресценция, отн. ед.
250 г
200 150 100 50 0
Рис. 2. Связывание FITC-конъюгированных моно-клональных антител к CD 11b с нейтрофилами (106 клеток/мл). 1 - контроль; 2 - рекомбинантный БТШ70 (1 мкг/мл); 3 - верблюжий БТШ70 (1 мкг/мл). а - нейтрофилы без LPS. б - нейтрофилы, инкубированные сначала с БТШ70, затем с LPS (100 нг/мл).
Апоптоз, % 110 г
100 90 80 70 60 50 40
Т
Т
Т
12 3 4
Т
Т
12 3 4
Рис. 3. Действие БТШ70 на апоптоз нейтрофилов. а -100 нг/мл LPS; б - рекомбинантный БТШ70; в - верблюжий БТШ70. 1 и 3 - без LPS, 2 и 4 - в присутствии LPS (100 нг/мл); 1, 2 - 100 нг/мл БТШ70, 3, 4 - 1 мкг/мл БТШ70. Апоптоз контрольных клеток принят за 100%.
в этих же концентрациях более эффективно снижал LPS-индуцированную задержку апоптоза нейтрофилов по сравнению с рекБТШ70 (рис. 3, 2в, 4в).
Ключевым механизмом активации клеток-мишеней при действии эндотоксинов является достаточно быстрое взаимодействие последних со специфическими рецепторами этих клеток. Анализ кинетики защитного действия обоих препаратов, использованных в работе с БТШ70, на образование активных форм кислорода нейтрофилами при воздействии LPS по регистрации люминолзависимой хемилюминесценции, показал, что максимальное ингибирование эндоток-син-индуцированной активации происходит через 4-5 мин после введения БТШ70. Небольшое различие в эффективности защитного действия исследованных БТШ70 может быть связано с наличием примесей LPS в препарате рекомбинантного БТШ70, так как под действием полимиксина B (антибиотика, связывающего LPS) происходит снижение ХЛ нейтрофилов до значений контрольных клеток (рис. 1, 1в, 2в, 3в).
При действии эндотоксинов происходит увеличение экспрессии P-2-интегриновых CD11b/CD18-рецепторов [3]. Эти рецепторы содержат специфическую область связывания LPS [12]. Предполагается, что эти рецепторы, как и CD14-рецепторы, осуществляют передачу эндотоксинов от лиганд-связующ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.