ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 435, № 3, с. 407-410
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.3:57.082+577.112.6
ЭКЗОГЕННЫЙ БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА Н8Р70 ПОДАВЛЯЕТ АКТИВАЦИЮ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ © 2010 г. М. М. Юринская, М. Б. Евгеньев, О. Ю. Антонова, М. Г. Винокуров
Представлено академиком Ю.В. Ильиным 14.04.2010 г. Поступило 17.06.2010 г.
В настоящее время в практической медицине нет эффективных средств защиты от грамотрица-тельного и грамположительного сепсиса. В настоящей работе на нейтрофилах человека, играющих ключевую роль в развитии сепсиса, показано, что экзогенный белок теплового шока с молекулярной массой 70 килодальтон (HSP70) имеет достоверное защитное действие от липопо-лисахарида и липотейхоевой кислоты.
Нейтрофилы играют центральную роль в воспалительном ответе организма человека (млекопитающих) при бактериальной инфекции. Активаторами патологических процессов в организме человека при сепсисе являются компоненты грам-отрицательных и грамположительных бактерий [1]. В распознавании бактериальных патогенов важная роль принадлежит клеточным То11 like-ре-цепторам (T1R) миелоидных клеток. T1R4- и T1R2-в кооперации с CDM-рецептором распознают соответственно грамотрицательные и грамположи-тельные бактериальные патогены. Липотейхоевая кислота (LTA) — главный компонент клеточных мембран грамположительных бактерий — вызывает стимуляцию функций нейтрофилов и моноцитов человека через активацию T1R2-, CD 14- и СЭ36-рецепторов [2, 3]. В активации миелоидных клеток под действием липополисахаридов (LPS, эндотоксинов) участвуют компоненты рецептор-ного комплекса T1R4/CD14/MD2, а также другие белки и рецепторы [4].
В патогенезе воспалительных заболеваний (в том числе и сепсиса) важная роль принадлежит нейтрофилам. LPS и LTA вызывают активацию нейтрофилов: увеличивают продукцию активных форм кислорода, TNFa, экспрессию р2-интегри-
Институт биофизики клетки
Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
Институт молекулярной биологии
им В.А. Энгельгардта
Российской Академии наук, Москва
Пущинский государственный университет
нов. Эти бактериальные патогены увеличивают продолжительность жизни циркулирующих в кровяном русле нейтрофилов, ингибируя их апо-птоз [2, 5].
При сепсисе в различных миелоидных клетках происходит увеличение синтеза и накопления белков теплового шока (HSP), в частности HSP70, играющего важную роль в механизмах защиты организма от теплового и других видов стресса и участвующего в механизме толерантности к эндотоксинам миелоидных клеток [6].
В последнее время показано, что экзогенный HSP70 оказывает защитное действие на клеточные культуры [7], увеличивает выживаемость животных в модели эндотоксинового шока [8], а также оказывает защитное действие на активацию ней-трофилов при действии липополисахаридов [9].
Целью настоящей работы было исследование действия экзогенного рекомбинантного белка теплового шока HSP70 на активацию нейтрофи-лов при действии липотейхоевой кислоты.
В работе использовали следующие вещества: среда RPMI-1640, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), иодид пропидия, HEPES, краситель Crystal Violet, раствор Хенкса (HBSS), пенициллин, стрептомицин, дигитонин, фиколл 400, фосфатный буфер, формил-метионил-лейцил-фе-нилаланин (fMLP), LPS из E. coli O55:B5, липотейхоевая кислота из Staphylococcus aureus ("Sigma", США).
Ген рекомбинантного человеческого белка HSP70 был клонирован для дальнейшей экспрессии под полиэдриновым промотором в бакмиду, как описано в [10]. Рекомбинантный человеческий HSP70, экспрессированный в клетках шелкопряда (Spodoptera) очищали на Ni-NTA-колон-ках согласно рекомендациям производителя (QIAGEN, Ni-NTA Superflow BioRobot Hand Book).
Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-слой-ном градиенте фиколла—верографина (1.119 г/мл
408
ЮРИНСКАЯ и др.
Хемилюминесценция, % Хемилюминесценция, % Хемилюминесценция, %
250 200 150 100 50 0
(а)
0 10 1001000 LTA, нг/мл
220 200 180 160 140 120 100 80 60
У
0 100 1000 HSP70, нг/мл
160
140
120
100
80
1
(в) I
0 100 1000 HSP70, нг/мл
Рис. 1. Действие липотейхоевой кислоты (ЕГЛ) и Н8Р70 на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами (а, б) и моноцитами (в) в присутствии (1) и в отсутствие (2) ЕГД. Концентрация ЕГД на б, в — 1 мкг/мл.
и 1.077 г/мл). Моноциты выделяли по методике центрифугированием мононуклеарной фракции на градиенте перколла плотностью 1.064 г/мл [10].
Жизнеспособность нейтрофилов и моноцитов контролировали методом проточной цитофлуо-риметрии с использованием иодида пропидия [9]. Жизнеспособность выделенных клеток составляла 98-99%.
Праймирование нейтрофилов проводили по [9] с некоторыми модификациями. Нейтрофилы в HBSS (1 • 106 клеток/мл) были праймированы 20 нг/мл LPS в течение 30 мин при 37°С, 5% СО2 в присутствии 2%-ной плазмы (пул плазмы 10 здоровых доноров хранился перед использованием при -70°С). Образцы помещали в люмино-метр 1250 LKB (Швеция). Клетки были стимулированы с 1 мкМ fMLP в присутствии 350 мкМ люми-нола. Хемилюминесценцию (ХЛ) регистрировали в течение 10 мин.
Продукцию TNFa нейтрофилами определяли по цитотоксическому действию образцов на клетки-мишени линии L-929. Клетки линии L-929 культивировали в 96-луночных планшетах по 2 • 104 клеток в 100 мкл на лунку в среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС, 1% Z-глютамина, 1% стрептомицина, 1% пенициллина при 37°С и 5% С02. Через 24 ч культивирования к образовавшемуся монослою клеток L-929 добавляли актино-мицин D ("Sigma") в концентрации 1 мкг/мл и затем по 100 мкл супернатанта нейтрофилов. К контрольным лункам добавляли только среду. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% С02, окрашивали красителем Crystal Violet и определяли выживаемость клеток после растворения кристаллов в 1%-ном растворе додецил-сульфата натрия. Оптическую плотность измеряли при 595 нм. Продукцию TNFa определяли по
индексу цитотоксичности [12]. Экспериментальные данные анализировали с помощью программы SigmaPlot.
В первой серии экспериментов исследовано действие рекомбинантного белка теплового шока на продукцию активных форм кислорода (АФК), продуцируемых нейтрофилами в ответ на действие LTA. Инкубирование нейтрофилов с липо-тейхоевой кислотой (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1 мкг/мл) значительно увеличивало величину ХЛ клеток по сравнению с контролем (рис. 1). HSP70 несколько увеличивал продукцию АФК нейтрофилами по сравнению с контрольными нейтрофилами (рис. 1б, 1). Значения ХЛ нейтрофилов в присутствии HSP70 и полимикси-на В практически не отличались от ХЛ контрольных клеток (данные не приведены). Предварительное инкубирование нейтрофилов в течение 5 мин с HSP70 (перед добавлением LTA) значительно снижало величину ХЛ клеток по сравнению с активацией в присутствии только LTA (рис. 1б). Защитное действие HSP70 от активации LTA также наблюдалось в экспериментах с моноцитами. Предварительное инкубирование моноцитов с HSP70 (перед добавлением LTA) снижало LTA-индуцированную активацию этих клеток (рис. 1в).
Во второй серии экспериментов проведено сравнительное изучение действия HSP70 на продукцию TNFa нейтрофилами в присутствии ли-пополисахарида и липотейхоевой кислоты. В отсутствие бактериальных патогенов HSP70 вызывал небольшое увеличение продукции TNFa контрольными нейтрофилами (рис. 2, К, 2). В присутствии LPS и LTA происходило увеличение продукции TNFa. При этом продукция TNFa при действии LPS более выражена, чем при действии LTA (150 и 50 пг/мл соответственно). Пред-
ЭКЗОГЕННЫЙ БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА
409
TNF a, пг/мл
180 -
160 -
140 -
120 -
100 -
80 -
60 -
40 -
20 _
Ол
0
к
LPS
LTA
Флуоресценция, отн. ед. 380
360 340 320 300 280 260 240 220 200
Рис. 2. Действие 5 мкг/мл HSP70 на продукцию TNFa нейтрофилами (5 • 106 клеток/мл) в отсутствие (1) и в присутствии (2) бактериального патогена. LTA — 1 мкг/мл, LPS — 1 мкг/мл.
варительное инкубирование нейтрофилов с 5 мкг/мл HSP70 в течение 5 мин значительно снижало продукцию TNFa нейтрофилами при действии LPS (47 пг/мл) и LTA (32 пг/мл) по сравнению с действием бактериальных патогенов в отсутствие HSP70 (рис. 2, LPS, 2, LTA, 2).
В третьей серии экспериментов исследовано действие HSP70 и LTA на экспрессию CDH^CD^^-цепторов в мембране нейтрофилов. LTA в концентрации 1 мкг/мл увеличивала экспрессию этих рецепторов нейтрофилов (рис. 3, 2), что согласуется с данными авторов работы [13]. HSP70 несколько увеличивал экспрессию этих рецепторов (рис. 3, 3). Предварительное инкубирование нейтрофилов с HSP70 (до добавления LTA) снижало экспрессию CD11b/CD18-рецепторов (рис. 3, 4) по сравнению с экспрессией рецепторов при действии только LTA (рис. 3, 2).
При действии бактериальных патогенов на миелоидные клетки происходит достаточно быстрое их взаимодействие со специфическими рецепторами клеток-мишеней. Анализ кинетики защитного действия HSP70 на образование АФК нейтрофилами при воздействии LTA показал, что максимальное ингибирование LTA-индуциро-ванной активации происходит через 4—5 мин после введения HSP70, что хорошо коррелирует с полученными ранее данными о кинетике защитного действия HSP70 на активацию нейтрофилов при действии LPS [9].
В наших экспериментах продукция АФК увеличивалась до 200% в интервале концентраций LTA от 0.01 до 1 мкг/мл (рис. 1а). Примерно такое
Рис. 3. Экспрессия СВ11Ъ/СВ18-рецепторов на ней-трофилах (106 клеток/мл). 1 — контроль; 2 — 1 мкг/мл LTA; 3 — 2 мкг/мл HSP70; 4 — нейтрофилы, инкубированные сначала с 2 мкг/мл HSP70, затем с 1 мкг/мл LTA.
же изменение активности нейтрофилов и моноцитов происходит при действии значительно более низких концентраций LPS (1—20 нг/мл) [2, 9]. Доставка LPS и LTA к специфическим ^R-рецеп-торам миелоидных клеток происходит с помощью CDM-рецепторов [2, 4], которых в нейтрофилах экспрессируется всего 7000 рецепторов (в отличие от моноцитов, в которых их экспрессируется 100000) [14]. При действии LTA на миелоидные клетки происходит увеличение экспрессии р2-инте-гриновых рецепторов адгез
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.