ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.55+543.94+543.37+543.63
ЭЛЕКТРОДЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БИОКОМПОЗИТНОЙ ПЛЕНКОЙ НА ОСНОВЕ ОКСИДА КРЕМНИЯ И НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА,
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
© 2015 г. Ю. В. Иминова*, О. Ю. Тананайко*, Т. С. Рожанчук*, Т. Г. Грузина**, Л. С. Резниченко**, М. Л. Малышева*, З. Р. Ульберг**
*Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, химический факультет, 01601 Украина, Киев, ул. Владимирская, 64 1E-mail: nadzhafova@univ.kiev.ua **Институт биоколлоидной химии им. Ф.Д. Овчаренко Национальной академии наук Украины 03142 Украина, Киев, бульв. Акад. Вернадского, 42 Поступила в редакцию 08.04.2014 г., после доработки 26.12.2014 г.
Выполнено модифицирование угольного и золотого электродов биокомпозитной пленкой на основе оксида кремния, гемоглобина (hemoglobin, Hb) и глюкозооксидазы (glucose oxidase, GOx) методом осаждения с использованием электрогенерированного катализатора. Иммобилизированные в пленке белки сохраняют каталитическую активность в течение трех недель. Стабильность аналитического сигнала модифицированного электрода значительно увеличивается при введении в золь наноча-стиц Au диаметром 20 нм и бромида цетилтриметиламмония (20 ККМ). Золотой электрод, модифицированный биокомпозитной пленкой SiO2—Hb—GOx—Au, использован для вольтамперометрического определения глюкозы в модельных растворах и сыворотке свиной крови. Градуировочный график линеен в интервале 0.015—0.20 мМ, предел обнаружения — 0.008 мМ глюкозы. Разработанный способ модифицирования перспективен для получения чувствительных элементов биферментных амперометриче-ских сенсоров.
Ключевые слова: пленка SiO2, гемоглобин, глюкозооксидаза, наночастицы Au, вольтамперометрия, биосенор, глюкоза.
Б01: 10.7868/80044450215080113
Разработка чувствительных элементов химических сенсоров для определения биологически активных соединений — перспективное направление электроаналитической химии [1, 2]. Важное место в этой области занимает разработка ферментативных сенсоров для определения органических субстратов в биологических жидкостях. Основными преимуществами таких сенсоров является избирательность, минимальная пробоподготовка образца, быстрота отклика и удовлетворительная чувствительность определения [3, 4]. Важной характеристикой иммобилизированных ферментов является сохранение их нативной структуры и конформационной подвижности в сочетании с прочностью закрепления и обеспечением максимального контакта активного центра фермента с молекулами субстрата [4, 5]. При использовании биферментных систем необходимо, чтобы иммо-билизированнные белки не уменьшали каталитическую активность друг друга. Важную роль в обеспечении этих условий играет микроокруже-
ние матрицы, в которой закреплены молекулы ферментов [5, 6].
Одним из перспективных способов закрепления биомолекул на поверхности электродов является их инкапсуляция в полимерной матрице на основе 8Ю2, полученного методом низкотемпературного золь—гель синтеза [7—10]. По отношению к биомолекулам 8Ю2 химически инертен и прочно их удерживает в своей полимерной сетке. Варьируя условия золь—гель синтеза, можно получать материалы в виде мезоструктурированных трехмерных покрытий, что позволяет наносить последние на поверхность электродов. Белок, находящийся внутри такого покрытия, более устойчив к действию химических и физических факторов и в то же время сохраняет конформационную подвижность и каталитическую активность [7—10].
Для получения пленок на основе 8Ю2 на поверхности электродов оптимизирован метод осаждения с использованием электрогенерирован-ного катализатора [11—15]. Это — простая и быст-
рая процедура модифицирования, суть которой состоит в наложении на рабочий электрод, погруженный в содержащий белок водный золь SiO2, отрицательного потенциала в течение 5—10 с. В результате восстановления молекул воды на электроде в приэлектродом пространстве синтезируются гидроксид-ионы, являющиеся катализатором процесса золь—гель синтеза. На поверхности электрода за 10—15 мин образуется пленка SiO2, содержащая капсулированные биомолекулы. Ранее нами установлены оптимальные условия получения таких биокомпозитных пленок на основе SiO2, содержащих гемоглобин, на поверхности уг-леситалловых электродов и разработан чувствительный элемент амперометрического сенсора для определения растворенного в воде кислорода [11, 13, 14].
Глюкозооксидаза — один из наиболее широко используемых в биосенсорах фермент [16—18]. Это — удобная модельная система для разработки новых способов иммобилизации ферментов и получения чувствительных элементов амперометри-ческих сенсоров. При определении глюкозы удобно детектировать растворенный в воде кислород или образующийся пероксид водорода, концентрация которых изменяется пропорционально концентрации глюкозы.
Проблемой многих биосенсоров является невысокая стабильность аналитического сигнала, а также необходимость использования медиаторов для улучшения чувствительности и селективности определения. Разработка безмедиаторных биосенсоров, в которых иммобилизированные биомолекулы в наибольшей степени приближены к поверхности электрода, дает возможность максимально усилить электрокаталитические свойства белка и повысить чувствительность определения.
Для увеличения стабильности и интенсивно -сти аналитического сигнала биосенсоров перспективны наноматериалы, в частности наноча-стицы Au [14, 19—21]. Наночастицы Au образуют с белком стабильные золи за счет взаимодействия с тиольными и аминогруппами аминокислотных остатков белков [19—21]. Введение наночастиц Au в биополимерные пленки на основе SiO2 — перспективный способ повышения стабильности аналитического сигнала и чувствительности определения субстратов без применения медиаторов.
Цель настоящей работы — получение чувствительного к глюкозе биферментного электрода, модифицированного пленкой SiO2, содержащей гемоглобин, глюкозооксидазу и наночастицы Au, и его применение в качестве чувствительного элемента амперометрического сенсора.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реагенты. Использовали реактивы квалификации х. ч. и тридистиллят. Золь—гель синтез проводили кислотным гидролизом тетраэтоксисилана (98%, Fluka). В качестве добавок в процессе золь-гель синтеза использовали цетилтриметиламмо-ний бромид (ЦТАБ), Sigma; гемоглобин человеческий, Мг = 64 кДа, Sigma; глюкозооксидазу из Aspergillusniger (EC 1.1.3.4), Mr = 160 кДа, удельная активность >100000 отн. ед./г, Sigma. Золь золота (диаметр частиц 20 нм) получен в лаборатории Института биоколлоидной химии Национальной академии наук Украины. Фосфатный буферный раствор готовили из растворов КН2РО4 и Na2HPO4. Сыворотку получали из свиной крови по стандартной методике [22].
Аппаратура. Использовали вольтамперометр ABA-2 (Буревестник, С.-Петербург, Россия). Все измерения проводили при 18 ± 2°С в трехэлектрод-ной ячейке, содержащей модифицированный рабочий, Ag/AgCl-электрод сравнения и Pt вспомогательный электрод. Рабочие электроды - углеситал-ловый (A = 0.16 см2) (С.-Петербург, Россия) и золотой микроэлектрод (A = 0.03 см2) (Нанси, Франция). Кислотность растворов контролировали иономером I-130 (С.-Петербург, Россия).
Размер коллоидных частиц в водных золях оценивали методом динамического рассеяния света на Mastersizer Particle Size Analyzers (Malvern, (Великобритания), а также методом спектра мутности [23]. Спектры поглощения золей регистрировали на UV/Vis-спектрофотометре SQ 2800 (Unico, Китай) в диапазоне длин волн 350-1000 нм относительно воды в кварцевых кюветах (€ = 1 см).
Получение золь—гель модифицированного электрода. Электроды модифицировали методом осаждения, используя электрогенерированный катализатор, по ранее описанной методике [11, 13, 14]. Перед модифицированием электроды полировали алмазной пастой, промывали этанолом и водой и сушили 1 ч при 90°C. Золь-гель пленки на поверхности электродов получали из золя SiO2, содержащего добавки ЦТАБ, смесь белков 0.40 мМ Hb и 0.15 мМ GOx и наночастицы Au. Золь вводили в электрохимическую ячейку, затем погружали в нее рабочий электрод и выдерживали при Е = -1.2 В в течение 7 с при комнатной температуре [11, 14]. На поверхности электрода образовывалась едва различимая глазом пленка SiO2-Hb-GOx или SiO2-Hb-GOx-Au. Модифицированный электрод промывали водой, сушили в течение 60 мин на воздухе и хранили при 4°C, если не использовали сразу.
Методика вольтамперометрических измерений.
В качестве фона использовали 0.01 М фосфатный буферный раствор с рН 6.5, содержащий 0.01 М KN03. Электроды погружали в электролитическую ячейку, содержащую фон, ячейку герметич-
но закрывали и перемешивали раствор магнитной мешалкой в течение 5 мин. Перемешивание прекращали и регистрировали вольтамперограммы в диапазоне от +0.30 до —0.60 В при скорости развертки потенциала 100 мВ с-1. Аналогичные измерения проводили в растворе, содержащем добавки глюкозы. Аналитическим сигналом являлась величина каталитического тока восстановления кислорода (/кат) на модифицированном электроде.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристики углеситаллового электрода, модифицированного Ш и GOx. На немодифициро-ванном углеситалловом и модифицированном пленкой 8Ю2—¿Ох электродах вольтамперограм-мы фонового раствора в отсутствие и в присутствии глюкозы идентичны. На вольтамперограмме фона на углеситалловом электроде, модифицированном пленкой 8Ю2—НЬ, появляется катодный ток при —0.15 В (рис. 1а), соответствующий каталитическому току восстановления растворенного кислорода [13, 14, 24]. Ток остается неизменным в присутствии глюкозы в растворе (рис. 1а). При введении в раствор, содержащий глюкозу, фермента ООх ток кислорода уменьшается вследствие ферментативного окисления глюкозы, что сопровождается понижением содержания растворенного кислорода [4, 5]. На вольтамперограмме электрода, модифицированного смесью двух белков 8Ю2—НЬ—ООх, в присутствии глюкозы в растворе также наблюдается уменьшение каталитического тока восстановления кислорода по сравнению с фоновым раствором (рис. 1б). Ток уменьшается пропорционально содержанию глюкозы в растворе. Полученные данные свидетельствуют о том, что
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.