ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 6, с. 667-671
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ^
УДК 544.6.018.2:577.323.23
ЭЛЕКТРОДЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ, ДЛЯ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ДНК-СЕНСОРОВ
© 2007 г. Т. И. Абдуллин*, И. И. Никитина*, Д. Г. Ишмухаметова*, Г. К. Будников**,
О. А. Коновалова***, М. X. Салахов***
*Казанский государственный университет, биолого-почвенный факультет 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18 **Химический институт им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета ***Казанский государственный университет, физический факультет Поступила в редакцию 25.08.2006 г.
Осуществлена модификация стеклоуглеродных электродов (СУЭ) предварительно окисленными многостенными углеродными нанотрубками (УНТ). По данным атомно-силовой микроскопии слои УНТ на СУЭ обладают однородной наноструктурированной поверхностью. Вольтамперометриче-ские свойства СУЭ/УНТ зависят от нагрузки модификатора. Гуанин и дезоксигуанозинмонофосфат сильно адсорбируются на СУЭ/УНТ и окисляются при +690 и +930 мВ (pH 7.0) соответственно. Ток окисления гуаниновых нуклеотидов ДНК, адсорбированной на СУЭ/УНТ, существенно выше для термически денатурированного биополимера, чем для нативного. Полученные результаты представляют интерес для разработки сенсоров, основанных на электроактивных свойствах нуклеиновых кислот.
Углеродные нанотрубки (УНТ) активно исследуют в разных областях современной науки благодаря их уникальным структурным и физико-химическим свойствам. Большие перспективы имеет применение УНТ в электроноаналитической химии и биосенсорах.
Предложены различные способы конструирования электродов на основе УНТ. Это модификация электродов путем нанесения слоев УНТ [1-3], введения УНТ в состав паст [4, 5] или твердых композиций [6, 7], абразивного нанесения [8, 9] и формирования вертикально ориентированных монослоев [10, 11].
Как одностенные, так и многостенные УНТ проявляют выраженное электрокаталитическое действие в редокс-процессах с участием различных соединений [3-9]. Значительное усиление тока окисления при существенном понижении потенциала на электродах, модифицированных УНТ, продемонстрировано, в частности, для дофамина [4, 5], никотинамидадениндинуклеотида [6, 7], адреналина [8], серосодержащих аминокислот [9] и других биологических метаболитов.
Способность УНТ ускорять электродные реакции и их высокоорганизованная наноструктура обусловливают широкие возможности их применения для разработки электрохимических биосенсоров. Наряду с ферментами, важным биораспознающим компонентом электрохимических биосенсоров являются нуклеиновые кислоты. Модификация электродов УНТ помогает улучшить рабочие характеристики ДНК-сенсоров, в которых детекти-
рование специфических последовательностей ДНК осуществляется с помощью низкомолекулярных редокс-индикаторов [1] или ферментных меток [2]. Использование УНТ в биосенсорах, основанных на электроактивных свойствах самих нуклеиновых кислот, представляет значительный интерес из-за возможности прямого детектирования ДНК в отсутствие дополнительных меток или индикаторов. В качестве регистрируемого сигнала в таких биосенсорах обычно используют ток окисления гуаниновых и/или аденининовых нуклеотидов [12].
Известно, что электроокисление нуклеозидов и их фосфатов (нуклеотидов) наблюдается при сильно положительных потенциалах. Гуанозин и гуаниновые нуклеотиды окисляются при потенциалах, близких к +1 В (отн. хлоридсеребряного электрода) [12, 13], но из-за низкой скорости переноса электронов на большинстве электродов [14] чувствительность определения ДНК низка. Работы последних лет показывают, что модификация электродов УНТ облегчает электроокисление азотистых оснований и нуклеиновых кислот и значительно усиливает регистрируемый сигнал [5, 15-17], что актуально для разработки чувствительных ДНК-сенсоров.
Настоящая работа посвящена созданию электродов на основе многостенных УНТ и их изучению в качестве электрохимических преобразователей для прямого детектирования нуклеиновых кислот.
A 0.150
0.125
0.100
0.075
200
250
300
350
400
X, нм
Рис. 1. УФ-спектр поглощения разбавленного раствора УНТ.
серебряного электрода сравнения (Ag |AgQ); про-тивоэлектродом служила никелевая пластина.
СУЭ полировали оксидом алюминия (размер частиц 0.5 мкм), ополаскивали ацетоном и промывали дистиллированной водой. Для модификации поверхности СУЭ наносили 2 мкл суспензии УНТ и медленно высушивали. СУЭ/УНТ промывали при перемешивании в рабочем буферном растворе и записывали вольтамперограммы до получения воспроизводимых кривых.
Для адсорбции гуанина (1.5 мМ), аденина (5.0 мМ), дГМФ (6.0 мМ) или ДНК (1.4 мг/мл) 5 мкл раствора вещества наносили на поверхность СУЭ/УНТ, выдерживали установленное время и затем отмывали электроды в перемешиваемом буферном растворе. Далее электроды помещали в электролит, не содержащий электроактивных компонентов, и регистрировали вольтамперограммы в интервале от +200 до +1300 мВ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Использовали гуанин, 2'-дезоксигуанозин-3'-монофосфат (дГМФ), аденин, аденозин-5'-трифос-фат и высокомолекулярную ДНК тимуса теленка (Serva, Германия). Концентрации измеряли спек-трофотометрически [18]. Для улучшения растворимости в растворы гуанина и аденина добавляли небольшое количество HCl.
Для денатурации ДНК раствор нагревали при 100°C в течение 15 мин и затем охлаждали в ледяной бане.
Многостенные УНТ фирмы Sigma-Aldrich (Германия) имеют внутренний диаметр 1-3 нм, внешний диаметр 3-10 нм, длину 0.1-10 мкм. Для дополнительной очистки и приготовления водной суспензии УНТ подвергали ультразвуковому диспергированию в смеси конц. H2SO4 и HNO3 (3 : 1), как описано ранее [19]. Окисленные УНТ центрифугировали и многократно промывали бидистил-лятом.
Оптические спектры растворов УНТ регистрировали на двухлучевом спектрофотометре Lambda-35 (Perkin Elmer, США).
Морфологию поверхности стеклоуглерода и слоев УНТ исследовали на атомносиловом микроскопе Solver P47H (ЗАО "НТ-МДТ", Москва) в полуконтактном режиме в воздушной среде с использованием сканера 50 х 50 цт и стандартных кремниевых кантилеверов NSG11 (ЗАО "НТ-МДТ").
Вольтамперометрические измерения проводили при помощи компьютеризированного анализатора Экотест-ВА ("Эконикс-Эксперт", Россия) в 0.01 M фосфатном (pH 7.0) или ацетатном (pH 5.0) буферных растворах, содержащих 0.1 M NaCl в качестве фонового электролита. Трехэлектрод-ная ячейка состояла из рабочего стеклоуглерод-ного электрода (СУЭ) диаметром 1.5 мм, хлорид-
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Свойства электродов, модифицированных УНТ
Установлено, что приготовленная водная суспензия УНТ интенсивно поглощает свет в УФ-об-ласти (Хтах 260 нм) (рис. 1), что характерно для ароматических соединений [20]. Известно, что стенки УНТ гомологичны по своей структуре ба-зальной плоскости высоко-ориентированного пи-рографита и состоят из сконденсированных ше-стичленных циклов с атомами углерода, находящимися в зр2-гибридизации [21], что предполагает наличие у УНТ ароматических структур, сходных с п-электронной системой бензола. Вероятно, наблюдаемый максимум поглощения УНТ при 260 нм соответствует первым полосам поглощения бензола с максимумом при 180 нм, который в результате конденсации ароматических циклов претерпевает батохромный сдвиг до 251 нм в ряду бензол, нафталин, антрацен [20].
Оптическая плотность разбавленных растворов УНТ при 260 нм была пропорциональна разведению вещества, что позволило использовать спектрофотометрию для оценки концентрации УНТ. Этот метод отличается простотой и допускает сравнение концентраций растворов УНТ, приготовляемых в различных условиях. Из-за отсутствия коэффициентов экстинкции для УНТ, концентрацию вещества выражали в единицах оптической плотности, которая с учетом разведения используемых растворов принимала значения более 2.
Изучение топологии слоев УНТ на стеклоуг-лероде методом атомно-силовой микроскопии показало, что они состоят из червеобразных наноструктур диаметром около 10 нм (рис. 2а). Эти структуры переплетены между собой и образуют массивные агломераты, что затрудняет определе-
350
250
150
50
100
80
60
40
20
I, мкА 4
600
-300
300 600 900 Е, мВ отн.
Рис. 2. Топографическое АСМ-изображение слоя УНТ на СУЭ (а) и чистого СУЭ (б).
ние длины нанотрубок. Отполированный стекло-углерод, в отличие от слоя УНТ, обладает более аморфной и ровной поверхностью (рис. 26). Среднеквадратичная шероховатость (а) для стеклоуг-лерода и слоя УНТ составила около 10 и 40 нм, соответственно, что свидетельствует об увеличении реальной площади поверхности электрода в результате модификации. Значения а варьировались незначительно для слоев, получаемых из насыщенных суспензий УНТ, концентрации которых соответствовали оптической плотности в диапазоне приблизительно 100-30 единиц. Однако дальнейшее разбавление суспензий УНТ приводило к агрегации вещества в процессе модификации и формированию неоднородных слоев на поверхности СУЭ.
Циклические вольтамперограммы на СУЭ/УНТ характеризуются более высокими фоновыми токами, чем на чистых СУЭ, и содержат две волны восстановления и одну пологую волну окисления
Рис. 3. Циклические вольтамперограммы СУЭ, модифицированных УНТ, для различной нагрузки модификатора. Ацетатный буфер, рН 5.0, скорость развертки 100 мВ с-1. Концентрация УНТ увеличивается в интервале 10-70 единиц оптической плотности от внутренней к внешней кривой.
(рис. 3). Очевидно, при рН 5.0 волны восстановления/окисления СУЭ/УНТ в интервале потенциалов от -150 мВ до +150 мВ (отн. Ag/AgCl) соответствуют редокс-процессу самих УНТ, обусловленным обратимым восстановлением карбоксильных групп до спиртовых, как показано ранее [3]. Ступень, появляющаяся на вольтамперограммах СУЭ/УНТ при более отрицательных потенциалах, по-видимому, соответствует необратимой реакции восстановления молекулярного кислорода. Фоновые токи модифицированных СУЭ зависят от нагрузки УНТ (рис. 3). С уменьшением концентрации УНТ, используемой для модификации, в исследуемом диапазоне 100-30 единиц оптической плотности наблюдается уменьшение токов на СУЭ/УНТ, мало изме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.