ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2008, том 58, № 2, с. 202-208
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ^^^^^^^^^^^^ ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 612.833+612.822.5+591.51
ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТОВ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ КОФЕИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ УСЛОВНОГО ОБОРОНИТЕЛЬНОГО РЕФЛЕКСА
У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ
© 2008 г. Д. И. Силантьева, Т. X. Гайнутдинова, В. В. Андрианов, X. Л. Гайнутдинов
Лаборатория биофизики Казанского физико-технического института КазНЦ РАН, e-mail: gainutdinov@mail.knc.ru; kh_gainutdinov@mail.ru Поступила в редакцию 05.06.2007 г. Принята в печать 12.11.2007 г.
Обнаружено, что хроническое введение кофеина виноградной улитке увеличивает скорость формирования условного оборонительного рефлекса. При этом в случае ежедневной инъекции кофеина сразу после процедуры обучения условный оборонительный рефлекс вырабатывается быстрее, чем при инъекции кофеина перед началом процедуры обучения. Показано, что хроническое введение кофеина как обученным, так и необученным улиткам приводит к де-поляризационному сдвигу мембранного потенциала и к уменьшению порогового потенциала командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки. В сравнительном исследовании было найдено, что при добавлении кофеина в раствор, омывающий нервную систему моллюска, снижается пороговый потенциал командных нейронов как у интактных, так и у обученных улиток; в то же время мембранный потенциал покоя не изменяется.
Ключевые слова: кофеин, обучение, условный оборонительный рефлекс, командные нейроны, мембранный потенциал, пороговый потенциал, ионы кальция.
Electrophysiological Study of Effects of Chronic Injection of Caffeine on Defensive Reflex Conditioning in Grape Snail
D. I. Silantyeva, T. H. Gainutdinova, V. V. Andrianov, Kh. L. Gainutdinov
Laboratory of Biophysics of Kazan Physical-Technical Institute, Russian Academy of Sciences, e-mail: gainutdinov@mail.knc.ru; kh_gainutdinov@mail.ru
It was found that chronic injection of caffeine to grape snail increases a velocity of elaboration of conditioned defensive reflex. It was shown that after daily injection of caffeine immediately after procedure of learning the conditioned defensive reflex elaborated faster than daily injection before procedure of learning. It has been shown, that chronic injection of caffeine both in naive as well as learned snails led to depolarizing shift of membrane potential and to decrease of threshold potential of command neurons of the defensive behaviour of grape snails. It was also found that addition of caffeine in bath solution led to decrease of threshold of generation of action potential of command neurons both in intact and learned snails. The resting membrane potential of command neurons was not changed.
Key words: caffeine, defensive reflex conditioning, command neurons, resting membrane potential, threshold potential, calcium ions.
Ионы кальция играют чрезвычайно важную роль в регуляции большого разнообразия нейронных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальным внутриклеточным посредником, связывающим процессы, разви-
вающиеся в поверхностной мембране клетки, с реакциями, протекающими внутри клетки [2, 10, 15, 25]. Общепризнанно, что внутриклеточный кальций, который находится в ионизированном виде, обладает функцией универсального вторичного посредника, участвующего в регуляции многих внутриклеточных реакций,
вплоть до генной экспрессии [2, 7, 12, 14, 19, 22]. Роль внутриклеточных ионов Са2+ можно рассмотреть в двух аспектах: их необходимость для индукции пластических модификаций и для поддержания изменений свойств нейронной мембраны, появившихся вследствие обучения. Одним из агентов, вызывающих увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+, является кофеин [8, 10, 23]. Установлено, что кофеин также ингибирует фермент фосфоди-эстеразу и повышает в клетках уровень циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), в результате происходит выход ионов Са2+ из сар-коплазматического ретикулума [5, 13, 16]. В последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что кофеин может оказывать противоположные влияния на разных стадиях консолидации памяти и что его воздействие зависит от формы обучения [9, 11]. В связи с этим основной задачей настоящей работы явилось исследование поведенческими и электрофизиологическими методами эффектов хронического введения кофеина при формировании условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки. Кроме того, были исследованы изменения параметров электрической активности командных нейронов интактных и обученных улиток при добавлении кофеина в раствор, омывающий изолированный препарат нервной системы моллюска.
МЕТОДИКА
Улиток (Helix lucorum) перед экспериментом не менее двух недель выдерживали в активном состоянии в стеклянном террариуме при комнатной температуре во влажной атмосфере. Условный оборонительный рефлекс (УОР) вырабатывали по схеме, предложенной группой исследователей [4]. В качестве условного стимула использовали постукивание по раковине. Безусловным стимулом служило вдувание струи воздуха в отверстие легочной полости, что вызывало у животных безусловную оборонительную реакцию закрытия пневмо-стома. Сочетание стимулов предъявляли с интервалом 2-4 мин, рефлекс вырабатывался в течение недели, в день предъявляли 60 сочетаний условного и безусловного стимулов. Результатом такого обучения являлось полное закрытие пневмостома в ответ на условный стимул, что отмечалось как положительная реакция. Рефлекс считался выработанным, когда в ответ на предъявление двух десятков
условных стимулов подряд происходило полное закрытие дыхальца в 100% случаев.
Было проведено две серии экспериментов: в первой серии на поведенческом и электрофизиологическом уровнях исследовали эффекты хронического введения кофеина, а во второй был проведен анализ влияния кофеина на электрические характеристики командных нейронов на изолированном препарате нервной системы моллюска.
Для исследований хронических эффектов моллюскам вводили кофеин в дозе 30 мг/кг массы животных [9], предварительно растворяя его в 0.1 мл физиологического раствора для виноградной улитки.
В этой серии было использовано пять групп животных: интактные улитки (18 животных); улитки, получавшие инъекции физиологического раствора за 30 мин до обучения (активный контроль, 11 животных); улитки, которым вводили кофеин за 30 мин до процедуры обучения (18 животных); улитки, получавшие инъекции кофеина сразу после процедуры обучения (18 животных); группа необученных улиток, которым ежедневно вводили кофеин в течение срока обучения последних двух групп (8 животных).
После поведенческих экспериментов на препарате изолированной центральной нервной системы моллюска регистрировали электрические характеристики командных нейронов оборонительного поведения: ЬРа3, ЯРа3, ЬРа2 и ЯРа2 [4]. Измерения проводили по стандартной методике при комнатной температуре (18-22°С) с применением внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, имевших сопротивление 5-30 МОм и заполненных раствором 2.5М КС1. В ходе эксперимента регистрировали мембранный потенциал (Уш) и порог генерации вызванных потенциалов действия У) нейронов. Потенциал покоя определяли по точке наименьшего изменения мембранного потенциала между спайками. Порог генерации потенциала действия определяли как разницу между потенциалом покоя и значением мембранного потенциала, при котором скорость нарастания потенциала (первая производная потенциала по времени) достигала определенного значения, в нашем случае 1 В/с. Поскольку командные нейроны ЛПа3, ППа3, ЛПа2 и ППа2 в норме являются молчащими, то в изолированном препарате для инициации в них потенциала действия использовали деполяризующий электрический ток, подаваемый внутрь
Доля положительных ответов
-а-ФР + УОР 100 b —о—кофеин после УОР -■-кофеин до УОР
80' 60
40
Ä
20
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Сочетания
Число сочетаний, необходимое для выработки УОР
Б
400-
и н а т е ч о С
300-
200
100
Кофеин после УОР
Кофеин до УОР
ФР + УОР
Рис. 1. Выработка условного оборонительного рефлекса у улиток, получивших инъекции кофеина и физиологического раствора. А - зависимость числа положительных ответов (в процентах) в 10 сочетаниях условного и безусловного стимулов от общего числа сочетаний; Б -число сочетаний условного и безусловного стимулов, необходимых для 100%-ного обучения животных разных групп. ФР + УОР - группа животных активного контроля, получивших инъекции физиологического раствора, Кофеин до УОР и Кофеин после УОР - группы животных, получавших кофеин соответственно до и после процедуры обучения. Fig. 1. Dynamics of development of defensive reflex conditioning in snails injected with caffeine and saline solution. А - dependence of number of positive responses (in %) in 10 pairs of conditioned and unconditioned stimuli from all pairs; Б - number of pairs of conditioned and unconditioned stimuli, required for 100% learning of animals of various groups. ФР + + УОР - animals of active control group, saline solution, Кофеин до УОР and Кофеин после УОР - groups of animals injected with caffeine respectively before and after learning.
клетки через регистрирующий микроэлектрод. При этом использовали минимальный ток, необходимый для генерации двух-трех
спайков. Для стимуляции использовали внутренний стимулятор микроэлектродного усилителя МС-01М (производство Минского государственного университета), на котором также осуществлялась компенсация потенциала кончика микроэлектрода.
Во второй серии экспериментов на одном нейроне производили измерения Vm и порога генерации потенциала действия (ПД) при аппликации кофеина. Через 30 мин после введения микроэлектрода в клетку добавляли кофеин за счет замены физиологического раствора, омывающего изолированную нервную систему моллюска, на аналогичный раствор, содержащий кофеин (Caffeine - 1,3,7-Trimeth-ylxanthine) в концентрации 2мМ. Заключительную регистрацию Vm и Vt производили через 30 мин после начала замены раствор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.