ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2008, № 2, с. 192-197
ХИМИЯ ПОЧВ
УДК 631.472.56:631.41
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ И ЭКСКЛЮЗИВНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ДЕТРИТА И ПОЧВ РАЗНОГО ГЕНЕЗИСА*
© 2008 г. О. Е. Трубецкая1, О. А. Трубецкой2, Б. А. Борисов3, Н. Ф. Ганжара3
1 Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,
Пущино Московской обл., ул. Институтская, 10 E-mail: trub@fibkh.serpukhov.su 2Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, Пущино Московской обл.
E-mail: trub@fibkh.serpukhov.su 3Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева, 127550, Москва,
ул. Тимирязевская, 49 E-mail: bborisov@rambler.ru Поступила в редакцию 08.12.2006 г.
Электрофорез в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих агентов и эксклюзивная хроматография на сефадексе G-75 (Sephadex G-75) в 7М мочевине были использованы для сравнительного анализа гуминовых веществ (ГВ), выделенных из чернозема типичного, дерново-подзолистой и каштановой почв, а также из соответствующих каждой почве легкоразлагаемых органических веществ (детритов). После электрофореза гель с естественно окрашенными полосами ГВ дополнительно окрашивали специфичным для белков красителем, помещая в раствор, содержащий Кумасси бриллиантовый голубой R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) и CuSO4. На основании электрофоретического и хроматографического анализов показано, что ГВ почв и соответствующих им детритов обладают существенными различиями, включающими отличие в интенсивности природной окраски электрофоретических фракций, молекулярно-массовом распределении, и впервые обнаруженном в данном исследовании различии в окраске электрофоретических фракций специфичным для белка красителем. Экспериментально подтверждено положение И.В. Тюрина и Л.Н. Александровой о том, что трансформация источников гумуса в гуминовые вещества идет в направлении от высокомолекулярных компонентов к низкомолекулярным.
ВВЕДЕНИЕ
К легкоразлагаемому органическому веществу (ЛОВ) почв относятся источники гумуса в разной степени разложения и гумификации, не связанные с минеральной частью почвы (вещества типа детрита). Поэтому понятия ЛОВ и детрит используются в статье как синонимы.
Различия в свойствах ГВ почв и ГВ ЛОВ следует искать в условиях их формирования и степени связи с минеральной частью почвы [2]. Для образования ГВ в составе детрита оптимальными являются: нейтральная или близкая к нейтральной реакция среды; умеренная биологическая активность и длительный ее период; высокое содержание кальция, магния и азота в поступающих растительных остатках; благоприятный биохимический состав источников гумуса (оптимальное отношение углерода к азоту, содержание легко-разлагаемых веществ).
Для прочного закрепления и накопления ГВ в почвах оптимальны следующие условия: наличие свободной от гумуса поверхности минеральной
* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ < 06-0448266 и гранта ИНТАС < 05-8055.
части почв; высокие сорбционные свойства (общая и удельная поверхность, степень дисперсности, минералогический состав и др.); насыщенность ППК кальцием и магнием (наличие их избытка для связывания гуминовых кислот); контрастность режима влажности при непромывном и периодически промывном режиме; отсутствие пептизаторов.
После закрепления в почвах ГВ подвергаются дальнейшей трансформации и обновлению. Однако следует учитывать и тот факт, что на свойства препаратов ГВ оказывает влияние процесс отделения их от минеральной части почв щелочным раствором. Учитывая вышеизложенное, в качестве объектов исследований выбраны контрастные типы почв с резко отличающимися условиями образования и накопления гумуса.
Ранее нами разработан оригинальный метод электрофореза в полиакриламидном геле [11], позволяющий разделять почвенные ГВ на фракции, различные по электрофоретической подвижности, молекулярным размерам и физико-химическим свойствам [4, 5, 8, 10]. Метод был успешно использован для оценки эффективности фракционирования ГВ с помощью эксклюзивной хроматографии на сефадексах [11] и ультрафиль-
Состояние органического вещества в исследуемых почвах (% к массе почвы)
Почва С общ С вытяжки из почвы С гк С фк С гк/С фк С лов С вытяжки из ЛОВ С вытяжки из ЛОВ/С лов, %
Дерново-подзолистая 1.34 0.75 0.35 0.40 0.9 0.12 0.0056 4.7
Чернозем типичный 5.62 2.54 1.80 0.74 2.4 0.41 0.0217 5.3
Каштановая 1.27 0.54 0.29 0.25 1.2 0.09 0.0064 7.1
трации [7], а также для сравнения водных и почвенных ГВ [3], гуминоподобных веществ типа меланинов и лигнинов [9]. Цель настоящей работы -применение электрофореза и эксклюзивной хроматографии для сравнительного анализа препаратов ГВ, выделенных из трех почв различного генезиса и соответствующих им детритов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Образцы почв были взяты из гор. А1 дерново-подзолистой среднесуглинистой почвы на покровном суглинке (Московская обл.), гор. А чернозема типичного тяжелосуглинистого на лёссе (Курская обл.) и каштановой среднесуглинистой почвы на лессовидном суглинке (Волгоградская обл.).
Определение содержания легкоразлагаемого органического вещества и выделение препаратов ЛОВ проводили способом флотации в тяжелой жидкости по методу Ганжары и Борисова [2]. Содержание углерода гумуса и углерода ЛОВ определяли на анализаторе углерода - АН-7529.
Почвенные ГВ и ГВ ЛОВ получали экстракцией 1 г сухого вещества (измельченного в ступке детрита или предварительно очищенной и просеянной почвы) 100 мл раствора 0.1 М пирофосфата натрия и 0.1 М КаОИ (рН 13.0) в течение 24 ч при медленном перемешивании. Супернатант отбирали, фильтровали через бумажный фильтр для удаления крупных частиц, затем центрифугировали при 45000 g в течение 45 мин для удаления основной массы минеральных коллоидов. Экстракт ГВ диализовали в течение 7 суток против дистиллированной воды и лиофилизовали, смену воды проводили 2 раза в сутки. Сухие препараты ГВ из почв и детритов использовали для дальнейших исследований.
Фракционирование ГВ электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих агентов мочевины и додецил-сульфата натрия проводили по ранее описанной методике [6, 11]. Количество ГВ, наносимого на 10%-ный полиакриламидный гель было одинаково для почв и детритов (0.15 мг). После электро-
фореза гель с естественно окрашенными полосами ГВ фотографировали, затем окрашивали специфичным для белков красителем, помещая на 4 ч в раствор, содержащий 15% уксусной кислоты, 15% этилового спирта, 0.025% Кумасси бриллиантового голубого И-250, 1% Си8О4. Затем гель отмывали до прозрачного фона раствором, содержащим 10% уксусной кислоты и 10% этанола, в течение суток. Далее окрашенный гель фотографировали.
Для проведения хроматографии 10 мг почвенных или детритных ГВ растворяли в 1 мл 7М мочевины и наносили на хроматографическую колонку с сефадексом в-75 (1.5 х 100 см), уравновешенным раствором 7М мочевины. Скорость элюции составляла 15 мл/ч, выход ГВ с колонки детектировали с помощью проточного спектрофотометра при длине волны 280 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гумусовое состояние исследуемых почв (таблица) характеризуется сильной контрастностью по всем показателям и является типичным для данных подтипов почв. Следует отметить, что содержание гумифицированных ЛОВ, о котором можно судить по содержанию углерода в 0.1 н. КаОИ вытяжке из ЛОВ, нарастает от дерново-подзолистых почв к черноземам, но в целом эти показатели довольно близки и не выходят за пределы 10%. ГВ, выделенные из почв и детритов трех почв различного генезиса, были фракционированы электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих агентов (рис. 1, I). Независимо от генезиса все почвенные и детритные ГВ разделились на четыре дискретные естественно окрашенные электро-форетические зоны: А - стартовую, не проникающую в поры 10%-ного полиакриламидного геля; В - узкую зону в средней части геля; С и Б -зоны, находящиеся в нижней части геля и объединенные во фракцию С + Б из-за их близких элек-трофоретических подвижностей. Ранее нами показано, что, независимо от генезиса почвенных
Курский Дерново-подзолистая Каштановая чернозем почва почва
12 12 12
II
В
С + Б
А
В
С + Б
I
Рис. 1. Электрофорез в 10%-ном полиакриламидном геле 0.15 мг ГВ, выделенных из трех почв различного генезиса (1) и соответствующих детритов (2). I - естественная окраска, II - окраска геля Кумасси Я-250. А, В и С + Б - электро-форетические зоны ГВ почв и детритов.
ГВ, фракция А имеет наибольший молекулярный размер, а фракция С + Б - наименьший [4, 11].
Следует отметить, что одинаково обозначенные на электроферограммах зоны почвенных и детритных ГВ имели сходную электрофоретиче-скую подвижность, но значительно различались по интенсивности естественной окраски. Так, электрофоретические фракции ГВ чернозема и каштановой почвы имели более интенсивную окраску, чем ГВ ЛОВ соответствующих почв. Однако для ГВ дерново-подзолистой почвы наблюдали обратную картину - интенсивность естественной окраски электрофоретических фракций почвенной ГВ на электроферограмме значительно снижена по сравнению с таковой у ГВ ЛОВ. Возможной причиной этого является преобладание фульвокислот и близких к ним по многим свойствам бурых гуминовых кислот в составе ГВ дерново-подзолистой почвы, в отличие от чернозема и каштановой почвы.
Как известно, в процессе гумификации происходит биотическая и абиотическая трансформация биологических материалов в зрелые ГВ. Логично предположить, что в составе ЛОВ доля нетранс-
формированного биологического материала будет превышать таковую в зрелых почвенных ГВ. Для получения экспериментальных доказательств по-лиакриламидный гель с естественно окрашенными электрофоретическими зонами почвенных и детритных Гв сразу после электрофореза окрашивали специфичным для белков анионным красителем Кумасси бриллиантовым синим (рис. 1, II). Отрицательно заряженные сульфогруппы используемого красителя в кислой среде связываются с положительно заряженными аминогруппами белков за счет кулоновского взаимодействия. Для блокирования избытка карбоксильных групп ГВ в окрашивающий раствор д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.