Фармацевтические науки
Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Чукарин А.В., соискатель Малкова Т.Л., кандидат фармацевтических наук, зав. кафедрой (Пермская государственная фармацевтическая академия)
ЭЛЕМЕНТНЫЙ И а-ПИРОННЫЙ СОСТАВ ПЕРЦА ОПЬЯНЯЮЩЕГО (КАВА-КАВА, PIPER METHYSTICUM)
В статье изучен и описан элементный и а-пиронный состав перца опьяняющего: органические компоненты определялись методами хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) и газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) после пробоподготовки с использованием твердофазной экстракции (ТФЭ); минеральный состав - методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой (ИСП-АЭС, ИСП-МС) после кислотного разложения с использованием систем микроволновой пробоподготовки. Разработаны экспрессные способы идентификации Piper methysticum. Впервые установлен макро- и микроэлементный состав измельченных корневищ перца опьяняющего двух сортов - Kuma Kua, Isa.
Ключевые слова: перец опьяняющий, Piper methysticum, кавалактоны, макро- и микроэлементы.
STUDY OF A-PYRON AND ELEMENTS COMPOSITION FROM INTOXICATING PEPPER (KAVA-KAVA, PIPER METHYSTICUM)
For the purpose of research liable consequences of usage Piper methysticum chemical composition were investigated. Organic components determined by thin layer chromatography and gas chromatography mass-spectrometry after solid phase extraction, inorganic components - by atomic emission spectrometry and mass-spectrometry with inductively coupled plasma. Express methods for identification major substances from Piper methysticum kava lactones were made. Macro- and trace elements composition dried rhizomes of Kava from 2 species (Kuma Kua, Isa) was observed.
Keywords: Intoxicating pepper, Piper methysticum, kava lactones, macro- and trace elements.
Введение
Растение перец опьяняющий (кава-кава, Piper methysticum) возделывают на островах южной части Тихого океана уже почти 3 тысячи лет, используя его для приготовления ритуальных и повседневных напитков. В последние десятилетия большое распространение во всем мире получили фитопрепараты и биологически активные добавки к пище (БАД), содержащие измельченные корневища перца опьяняющего и экстракты из них. В начале 21 века ежегодно на островах Тихого океана заготавливалось до 8000 т корневищ кава-кавы, не менее 50% из которых шло на экспорт. Например, в Германии в 2002 г. фитопрепараты и БАД с субстанцией перца выпускались более чем 20 фармацевтическими фирмами (Duo-pharm, Ratiopharm и др.) [5]. Однако после 24 официально зарегистрированных случаев серьезных повреждений функции печени в результате приема пищевых добавок с кава-кава (один человек скончался, троим были пересажены донорские органы, у остальных диагностировали цирроз печени, гепатит или печеночную недостаточность) в Германии, а позднее почти во всех странах Европы и в США, было принято решение о запрете использования любых частей растения и его экстрактов в БАД и безрецептурных лекарственных препаратах и фито-фармацевтических средствах [5,11]. Это переориентировало страны-производители на регионы, в которых не существовало запрета на использование кава-кава. Так, в России в 2003 г. было зарегистрировано 14 пищевых добавок, содержащих субстанции кава-кава (напри-
мер, БАД «Экстракт кава-кава. Безмятежное спокойствие», ЗАО «Эвалар»). С 15.01.2004 г. пищевые добавки, содержащие кава-кава, отнесли к списку № 1 сильнодействующих веществ (ПККН МЗ РФ: Протокол от 22.10.03 №2/88-2003), признали опасными для здоровья и запретили к применению на территории РФ. Постановлением Правительства РФ от 29 декабря 2007 г. N 964 Перец опьяняющий (кава-кава) и вещества, входящие в него, отнесены к сильнодействующим веществам, крупные размеры для целей статьи 234 УК РФ определены в размере 10 г.
Клинические проявления от употребления безрецептурных фитопрепаратов и БАД (распространяемых, в том числе и нелегально) до сих пор вызывают тревогу врачей-специалистов и дают основания полагать, что в их составе могут присутствовать субстанции запрещенных к использованию в БАД растений или веществ, в том числе сырья Piper methys-ticum или его экстрактов. Доказать этот факт стандартными судебно-химическими экспертизами или химико-токсикологическими исследованиями не представляется возможным в виду отсутствия надежных экспрессных методик идентификации перца опьяняющего.
Целью работы являлась разработка надежных и экспрессных способов идентификации перца опьяняющего в БАД, фитопрепаратах и сырье для их изготовления, а также установление качественного и количественного элементного и а-пиронного (кавалактонного) составов корневищ кава-кава для изучения влияния их на общую токсичность сырья кава-кава и субстанций на его основе.
Материал и методы
Кавалактоны из субстанций Piper methysticum выделяли с помощью ТФЭ, элюент - 96% этиловый спирт. В подготовленный картридж (смоченный этанолом) для ТФЭ AccuBond II EVIDEX 200 mg, 3 ml (Agilent Technologies, США), помещали навеску БАД, содержащую сухой экстракт корневищ Piper methysticum, массой 0,3 г, взвешенную на аналитических весах TB-215D, и заливали троекратно по 1 мл 96 % этиловым спиртом. После прохождения экстрагента через сорбент, полученное извлечение подвергали хроматографированию методами ТСХ и ГХ-МС. Элементному анализу методами ИСП-АЭС и ИСП-МС подвергали измельченные корневища кава-кавы 2 сортов (Kuma Kua и Isa) после кислотного разложения («мокрого озоления») с использованием систем микроволновой пробоподготовки.
ТСХ. Использовали хроматографические пластины HPTLC Kieselgel 60F254 (Merck KGaA, Германия), ПТСХ-АФ-А-УФ Sorbfil, (ЗАО «Сорбполимер», Россия), размерами 10*10 см., универсальный столик для нанесения образцов на пластины (с подогревом) УСП 1 М (температура подогрева на уровне 50оС). Нанесение исследуемых извлечений и метчиков осуществляли при помощи микрошприца на 0,01 мл (Agilent Technologies, США). Системы растворителей смешивали в требуемых соотношениях непосредственно перед использованием при помощи интенсивного перемешивания. Смеси заливали в хроматографическую камеру, стенки и дно которой прокладывали фильтровальной бумагой. Исследование проводили в стеклянных хроматографических камерах (Merck KGaA, Германия) прямоугольной формы, размером 18x6x18 см. Хроматографические пластины просматривали в видимом и УФ-свете (254 и 365 нм) с помощью облучателя хроматографического УФС-254/365 (ЗАО «Сорбполимер», Россия) до и после обработки проявляющими агентами.
ГХ-МС. Исследования проводили на приборе «6890-5973N» (Agilent Technologies, США), работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий. Температура инжектора и интерфейса составляли 250 и 280°С соответственно. Температура колонки программировалась от 100°С до 310°С с повышением температуры со скоростью 25°С/мин. Ввод образца объемом 2 мкл осуществляли методом с делением потока газа-носителя (1:30). Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 31 до 550 дальтон. Идентификацию веществ проводили по совпаде-
нию исследуемого масс-спектра с библиотечным спектром, с коэффициентом подобия, превышающим 90 %, рассчитанным по стандартной методике. Методом внутренней нормализации по площадям хроматографических пиков определяли количественное содержание компонентов в извлечениях, в том числе и а-пиронов (кавалактонов).
ИСП-АЭС и ИСП-МС. В исследованиях использовали последовательный атомно-эмиссионный спектрометр Optima 2000™ DV (PerkinElmer, США) и квадрупольный масс-спектрометр с индуктивно связанной плазмой Elan 9000 (PerkinElmer Sciex, США). Рабочий диапазон длин волн АЭС-спектрометра - 165-800 нм при спектральном разрешении 0,007 (при 193 нм). Спектральная полоса пропускания частот: 0,009 нм на 200 нм, 0,027 нм на 700 нм, монохроматор типа Эшелле. Экспозиция спектров осуществляли автоматически в интервале 0,01-500 с, количество реплик - произвольное. В спектрометре реализована спектральная коррекция фона с помощью алгоритма мультиспектральной фильтрации помех и фона (MSF).
Характеристики масс-спектрометра: диапазон сканирования масс, а.е.м.: 2-270; динамический диапазон системы детектирования: 1*10_1-1x109 имп/с; диапазон разрешения, а.е.м.: 0,3-3,0; пределы обнаружения: Be < 3 нг/л, Co < 1 нг/л, In < 0,5 нг/л, U < 0,5 нг/л; чувстви-
24 115 238
тельность (имп/с на 1 мкг/л): z"Mg > 4000, 11JIn > 30000, ZJÔU > 25000; кратковременная стабильность, СКО: <3%; долговременная стабильность, СКО: <4%; двузарядные ионы, Ba/Ba: <3% ; оксидные ионы, CeO/Ce: <3%; уровень фона на массе 220: < 25 имп/с; стандартное отклонение уровня фона на массе 220: < 5 имп/с [2].
Результаты и обсуждение
Изучение органического состава. Кавалактоны относятся к а-пиронам, ароматическим малополярным соединениям, что дает возможность использовать для их обнаружения методы газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), ГХ-МС и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [3,7,9,10,11]. С извлечениями из сухого экстракта корневищ кава-кавы, полученными с помощью ТФЭ, проводили исследования с помощью методов ТСХ и ГХ-МС.
ТСХ. В литературе было предложено несколько систем растворителей для хроматогра-фического разделения основных групп биологически активных веществ (БАВ) методом ТСХ: этилацетат : гексан (7:3); метанол : дихлорметан (9:1); 1,4-диоксан : n-гексан (18:82) [4,9,10]. В качестве проявителя использовали УФ-излучение (при 254 нм) или химический проявитель - пара-анисальдегид [4]. Была изучена пригодность этих систем растворителей для обнаружения основных групп БАВ из перца опьяняющего на пластинах Kieselgel 60F254 и Sorbfil: при просматривании пластин в УФ-свете зоны поглощения извлечений были неоднородными. В ходе работы подбирали другие соотношения растворителей этих систем, а также изучали возможность использования иных систем растворителей. Экспериментально установлено, что наилучшие условия разделения компонентов достигаются в системе растворителе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.