научная статья по теме ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ МЫШИ С МУТАЦИЕЙ К72W В ГЕНЕ СОМАТИЧЕСКОГО ЦИТОХРОМА С: ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА Биология

Текст научной статьи на тему «ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ МЫШИ С МУТАЦИЕЙ К72W В ГЕНЕ СОМАТИЧЕСКОГО ЦИТОХРОМА С: ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, том 43, № 4, с. 648-656

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 576.52;577.24 Ускоренная публикация

ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ МЫШИ С МУТАЦИЕЙ К72W В ГЕНЕ СОМАТИЧЕСКОГО ЦИТОХРОМА С: ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

© 2009 г. И. А. Муфазалов1' 2, Д. Н. Пеньков1, Б. В. Черняк3, О. Ю. Плетшшкина3, М. Ю. Высоких3, Р. В. Черткова4, М. П. Кирпичников4, Д. А. Долгих4, А. А. Круглов1, 2, Д. В. Купраш1, В. П. Скулачев2, 3, С. А. Недоспасов1, 3 *

1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991

2Факулътет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899 3Научно-исследователъский институт физико-химической биологии им. А Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899 4Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, 117997 Поступила в редакцию и принята к печати 06.03.2009 г. Представлена к публикации П.М. Чумаковым

Получены и охарактеризованы эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ) с точечной мутацией в гене соматического цитохрома С. Замена лизина в положении 72 на триптофан (K72W) уменьшила проапо-птотическую функцию цитохрома С в ответ на действие стауроспорина, сохранив при этом его способность участвовать в функции клеточного дыхания. Эта мутация не повлияла на характер или уровень экспрессии гена цитохрома С, а также на локализацию цитохрома С в клетке. Полученные нами культуры клеток представляют собой интересную модель для изучения апоптотических сигнальных каскадов и физиологических функций цитохрома С.

Ключевые слова: цитохром С, эмбриональные фибробласты мыши, апоптоз.

PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MOUSE EMBRYONIC FIBROBLASTS WITH K72W MUTATION IN SOMATIC CYTOCHROME C GENE, by I. A. Mufazalov1'2, D. N. Penkov1, B. V. Chernyak3, O. Y. Pletjushkina3, M. Y. Vyssokikh3, R. V. Chertkova4, M. P. Kirpichnikov4, D. A. Dolgikh4, A. A. Kruglov1'2, D. V. Kuprash1, V. P. Skulachev2'3, S. A. Nedospasov1'3' * (*Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: sergei.nedospasov@gmail.com; department of Bioengineering and Bioinformatics, Moscow State University, Moscow, 119899 Russia; 3Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Moscow State University, Moscow, 119899 Russia; 4Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997 Russia). Mouse embryonic fibroblasts (MEF) with point mutation in somatic cytochrome C gene were generated and characterized. It was shown that substitution of lysine for tryptophan in position 72 (K72W) decreased the proapoptotic functions of cytochrome C in response to staurosporin treatment without disrupting its respiratory functions. The presence of this mutation did not affect the pattern of cytochrome C gene expression or its localization inside the cell. These cell cultures therefore represent an interesting model for study ap-optotic signaling and physiological functions of cytochrome C.

Key words: cytochrome C, mouse embryonic fibroblasts, apoptosis.

Цитохром С в эукариотической клетке, наряду с хорошо известными биохимическими функциями по переносу электронов, необходимыми для процессов клеточного дыхания, служит важным медиатором апоптотического каскада [1, 2]. Известны две изоформы цитохрома С: соматическая и тестику-лярная. Эти изоформы выполняют в клетке аналогичные функции [3], а их гены расположены на ше-

* Эл. почта: sergei.nedospasov@gmail.com

стой и второй хромосомах соответственно [4]. После посттрансляционных модификаций цитохром С локализуется на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий и участвует в переносе электронов с дыхательного комплекса III на комплекс IV. При повреждении клетки и запуске одной из программ клеточной смерти цитохром С может высвобождаться в цитоплазму и, связываясь с Apaf-1 по dATP/ATP-зависимому механизму, способен иници-

ировать сборку апоптосомы - мультимерного белкового комплекса с молекулярной массой более 1300 кДа [5]. Апоптосома, в свою очередь, способна активировать предшественники каспаз - цистеино-вых протеаз, осуществляющих деградацию структурных компонентов клетки. Итогом этого процесса является образование пузырьков на клеточной мембране, конденсация хроматина, разрушение ядерной мембраны и формирование апоптотиче-ских телец. Такая последовательность событий характерна для клеток, подвергшихся воздействиям физической или химической природы (стрессу), и носит название внутреннего апоптического пути, ключевой этап которого - пермеабилизация внешней мембраны митохондрий и выход цитохрома С в цитоплазму. В противоположность внутреннему пути внешний апоптотический путь инициируется взаимодействиями лигандов (например FAS-L, TRAIL, фактор некроза опухолей (ФНО)) с клеточными рецепторами "смерти". В результате этих событий становится возможной активация эффекторных каспаз без формирования апоптосомы. В таком контексте этот путь можно назвать цитохром С-незави-симым.

Ранее с использованием бесклеточных систем и с введением экзогенного цитохрома С в клетки установили, какие аминокислотные остатки важны для проапоптотической функции цитохрома С. Оказалось, что чрезвычайно важен остаток лизина в положении 72 [6] Так, цитохром С, в котором этот остаток триметилирован, не способен запускать апоптотический каскад [7], а эмбриональные фибробласты мышей (МЭФ) с заменой К72А в молекуле цитохрома С существенно более устойчивы к таким видам стресса, как ультрафиолетовое излучение или обработка стауроспорином, чем клетки дикого типа [8].

Следует отметить, что мыши, лишенные многих компонентов апоптотического каскада, гибнут на различных стадиях эмбриогенеза или вскоре после рождения [9-15], поэтому МЭФ из таких мышей представляют собой удобный и доступный вид первичной культуры клеток, широко используемый для изучения функций генов и кодируемых ими белков.

В представленной работе мы сообщаем о получении и характеристике МЭФ из мышей с мутацией в гене соматического цитохрома С, приводящей к замене остатка лизина в положении 72 на триптофан (мутация K72W).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мыши и их генотипирование. Все этапы получения и фенотипические особенности линий мышей с мутацией в гене соматического цитохрома С будут подробно описаны в отдельной статье. Использованная для гомологичной рекомбинации генноин-женерная конструкция содержала фрагмент гена цитохрома С дикого типа, обрамленный сайтами ре-

K72W

1 т.п.н.

Oi

X

о „ bJ Рч

Экзоны Праймеры

I

Ис

1 2

Cyti2 Cytex2

Рис. 1. Структура локуса соматического цитохрома С с заменой лизина в положении 72 на триптофан. Показана схема локуса после гомологичной рекомбинации исходной конструкции и последующих рекомбинаций по LoxP- и Frt-сайтам, а также положения праймеров для ге-нотипирования. В случае генетически измененного локуса длина продукта ПЦР равна 673 п.н., что на 153 н. больше, чем у фрагмента, амплифицируемого с локуса дикого типа, из-за присутствия в интроне гена одного LoxP-сайта, одного Frt-сайта и адапторных последовательностей.

комбинации LoxP, маркер устойчивости к неомици-ну (NeoR), обрамленный Frt-сайтами, и фрагмент гена цитохрома С с мутацией K72W. Мыши с встроенной в один из аллелей конструкцией получены по стандартной технологии. В результате скрещивания этих мышей с трансгенными мышами, экспрес-сирующими гены рекомбиназы Flp и Cre в клетках зародышевого пути, получено потомство без участка NeoR и без фрагмента гена дикого типа в локусе цитохрома С (рис. 1). Таким образом получены мыши с мутацией K72W в одном или обоих аллелях гена цитохрома С. Животных содержали при 12-часовом световом дне и температуре 22°С. Воду и авто-клавированный корм давали ad libitum. Для обнаружения мутации K72W из биопсий хвоста выделяли ДНК, а затем проводили ПЦР с праймерами Cytex2 (5'-AGAGATGCAGAGGTTAAGTG) и Cytl2 (5'-TGACCTTGCCTTCTTCGG) (рис. 1). Амплификацию проводили по программе: 94°С, 3 мин; затем 32 цикла - 94°С, 30 с; 58°C, 1 мин; 72°C, 75 c; заключительная элонгация - 72°С, 5 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агароз-ном геле.

Получение и культивирование эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). МЭФ с гомозиготной мутацией K72W в гене соматического цитохрома C получали из эмбрионов от скрещивания гетерозиготных по этой мутации мышей. Для получения датированной беременности самок подсаживали к самцу (2 : 1) на ночь, утром проверяли наличие ко-пулятивной пробки. Момент обнаружения копуля-тивной пробки считали 0.5-м днем беременности. При достижении 13.5 дней беременности мышь эв-таназировали, извлекали матку, у эмбрионов удаляли голову и внутренние органы, оставшиеся ткани измельчали глазными ножницами, диссоциировали в 0.05%-ном растворе трипсин/EDTA и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, а затем кле-

точную суспензию переносили во флaкoн плoщa-дью 25 см2 для a^^rnrnix культур ("Grenier"). Дaлee клетки кyльтивиpoвaли в среде DMEM, coдepжaщeй 4.5 г/л глюкозы ("HyClone") и 10% фeтaльнoй сыворотки крупного скота ("HyClone"), при 370С в условиях 5% CO2 и 95%-ной влaжнocти. При достижении 80-85% монослоя клетки pacceвaли в соотношении 1 : 3, чacть клеточного мaтepиaлa иcпoльзoвaли для выделения ДИК и гeнoтипиpoвaния.

MЭФ с мyтaциeй K72A [8] любезно предоставлены A. Koмapoвым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA). Гомозиготные, гетерозиготные и контрольные клетки обозтачены KA/KA, KA/wt и wt/wt соответственно.

Измерение экспрессии генов соматической и те-стикулярной изоформ цитохрома С. Cyммapнyю PHK выделяли из MЭФ с помощью тpизoлa, o6pa-бaтывaли ДHKaзoй и oчищaли с иcпoльзoвaниeм RNeasy Mini Kit ("QIAGEN"). Koнцeнтpaцию PHK определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Nano Drop), тачество oбpaзцoв aнaлизиpoвaли методом элeктpoфopeзa в aгapoзнoм геле. Peaкцию oбpaтнoй тpaнcкpипции проводили со cлyчaйными пpaймepaми с помощью Reverse Transcriptase SS III ("Invitrogen"). В ячестве мaтpицы иcпoльзoвaл

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»