ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 428, № 4, с. 570-573
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.81:616.125.3:611.839
ЭНДО- И ЭКЗОЦИТОЗ ВЕЗИКУЛ В ИНТРАМУРАЛЬНЫХ НЕРВНЫХ ВОЛОКНАХ ПРАВОГО ПРЕДСЕРДИЯ КРЫСЫ
© 2009 г. Л. Ф. Нуруллин, Д. В. Абрамочки, Н. В. Тарасова, академик Л. В. Розенштраух,
член-корреспондент РАН Е. Е. Никольский
Поступило 06.05.2009 г.
Процессы эндо- и экзоцитоза лежат в основе передачи возбуждения и торможения в различных центральных и периферических синапсах организма [1—3]. Механизмы эндо- и экзоцитоза синаптических везикул успешно изучаются в нервно-мышечном соединении, где экзоцитоз обеспечивает квантовое высвобождение медиатора ацетилхолина (АХ) [4, 5]. В последнее время для исследования процессов экзоцитоза везикул помимо классических методов электрофизиологии стали широко использовать метод оптического мониторинга кругооборота везикул с помощью флуоресцентного красителя БЫ1-43 [6, 7].
В отличие от нервно-мышечных синапсов механизмы секреции медиаторов из интрамураль-ных вегетативных нервных окончаний, модулирующих сердечную деятельность, изучены крайне слабо. Данные электронной микроскопии показывают наличие многочисленных везикул в составе варикозных расширений холинергических и адре-нергических нервных окончаний в миокарде [8], что косвенно указывает на возможность квантовой секреции медиаторов в миокарде. Однако электрофизиологическими методами проверить справедливость этого предположения не представляется возможным, поскольку медиаторы, выделяющиеся из симпатических и парасимпатических окончаний, активируют метаботропные рецепторы и квант медиатора не способен вызвать генерацию типичного постсинаптического ответа, регистрируемого микроэлектродной техникой [9]. В связи с этим для проверки возможности существования квантового механизма освобождения медиаторов в миокарде мы решили показать наличие эндо- и экзоцитоза везикул при помощи флуоресцентного красителя БЫ1-43. Применение метода хрони-
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Институт экспериментальной кардиологии, Москва
Казанский государственный медицинский университет
ческой неонатальной десимпатизации, приводящей к устранению симпатических нервных волокон в миокарде, дало возможность сделать заключение о наличии процессов эндо- и экзоци-тоза везикул как в симпатических, так и в парасимпатических нервных волокнах.
В работе было использовано 20 самцов крыс линии Вистар массой 180—200 г, возрастом около 50 дней, на восьми из которых выполняли процедуру хронической неонатальной десимпатиза-ции. Для проведения исследования везикулярного цикла животных декапитировали, вскрывали грудную клетку и быстро выделяли сердце, которое промывали физиологическим раствором (состав, ммоль/л: NaCl - 130.0; KCl - 5.6; NaH2PO4 -0.6; MgCl2 - 1.1; CaCl2 - 1.8; NaHCO3 - 20.0, глюкоза — 11.0), насыщенным карбогеном (95% О2, 5% СО2). рН растворов поддерживался на уровне 7.4 ± 0.2. Для эксперимента выделяли препарат правого предсердия, включающий ушко предсердия, пограничный гребешок, межвенную область с синоатриальным узлом, а также часть межпред-сердной перегородки. Препарат закрепляли эн-докардиальной поверхностью вверх на дне экспериментальной камеры, через которую со скоростью 10 мл/мин протекал физиологический раствор с температурой 37.5°С.
Наличие и интенсивность экзо- и эндоцитоза в окончаниях постганглионарных нейронов в препарате правого предсердия оценивали путем выявления и анализа уровня флуоресценции скоплений везикул, меченных липофильным флуоресцентным маркером FM1-43 (2.5 ■ 10-6 М), образующихся в нервном волокне в ходе эндоцитоза. Для активации процессов эндо- и экзоцито-за проводили стимуляцию интрамуральных нервов по стандартной методике [10] в присутствии FM1-43. Частота стимуляции нервов составляла 100 имп/с, длительность стимула - 100 мкс, длительность серии стимулов - 15 с, интервал между сериями - 45 с. В ходе предварительных экспериментов было установлено, что ритмическое раздражение интрамуральных нервных волокон в течение 20 мин вызывает полную загрузку нервных окончаний флуоресцентным красителем. Затем
ЭНДО- И ЭКЗОЦИТОЗ ВЕЗИКУЛ 571
\
Рис. 1. а — флуоресценция интрамуральных нервных волокон правого предсердия крысы после 20 мин загрузки БМ1-43; б — разгрузка флуоресцентного маркера после 50 мин стимуляции в отсутствие БМ1-43 в растворе.
препарат "отмывался" от FM1-43 физиологическим раствором, содержащим циклогекс-трин ADVASEP-7 (2 ■ 10-4 M), который эффективно устраняет флуоресценцию неинтернализован-ного FM1-43, существенно снижая таким образом фоновую флуоресценцию. Для разгрузки красителя из окончаний постганлионарных нейронов использовали аналогичный протокол стимуляции в течение 50 мин. Загруженные маркером FM1-43 нервные волокна визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX51 с вод-ноиммерсионным объективом 40x ("Olympus", Япония) и широкополосным фильтром 510 нм ("Chroma", США). Для захвата изображений применяли камеру AxioCam MRm ("Zeiss", Германия). Возбуждение молекул красителя осуществляли с помощью монохроматора Polychrome V ("TILL Photonics", Германия) на длине волны 488 нм. Полученные изображения анализировали в программе ImageJ 1.42. Статистическую обработку проводили в программе OriginLab 7.5, использовали i-критерий Стьюдента.
Хроническую неонатальную десимпатизацию крыс проводили путем подкожного введения гуане-тидина сульфата ("Sigma Chemical Co.", St. Louis, MO) в межлопаточную область животных. Известно, что введение гуанетидина новорожденным крысам приводит к разрушению симпатических нейронов, в результате чего блокируется развитие симпатической нервной системы [11]. Раствор гуанетидина (в 0.9%-ном NaCl) вводили ежедневно в дозе 25 мг/кг с первого по 14-й дни жизни и 50 мг/кг с 15-го по 42-й дни. Контрольные крысы получали такой же объем 0.9%-ного раствора NaCl (1.0—2.5 мкл на грамм массы тела).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что в нервно-мышечном и многих других синапсах краситель БМ1-43, встраиваясь в плазматическую мембрану, "метит" везикулярные структуры, образующиеся в результате эндоцитоза во время стимуляции эфферентных нервных волокон [6]. При этом в ходе стимуляции наблюдается постепенное увеличение интенсивности флуоресценции нервных терминалей за счет накопления в них меченных красителем везикулярных структур. После удаления БМ1-43 из внешней среды повторная стимуляция приводит к ослаблению интенсивности окраски за счет экзоцитоза окрашенных везикул [6].
Наши эксперименты показали, что стимуляция области впадения верхней полой вены препарата по описанному выше протоколу в присутствии БМ1-43 в растворе выявляла протяженные флуоресцирующие волокна, которые можно идентифицировать как интрамуральные нервные волокна правого предсердия (рис. 1а). В исследованных волокнах наблюдалось регулярное расположение мест скопления флуоресцирующего материала по всему ходу аксона (рис. 1а). Поскольку спонтанная загрузка нервных окончаний при наличии БМ1-43 в среде в отсутствие стимуляции не наблюдалась, можно сделать вывод о том, что в интрамуральных волокнах правого предсердия заметная активация процесса эндоцитоза происходит только при их электрической активности.
Повторная стимуляция нервных волокон миокарда, меченных БМ1-43 в отсутствие флуоресцентного маркера в растворе, приводила к разгрузке нервных терминалей, что выражалось в постепенном падении интенсивности флуоресценции волокон. На 50-й минуте разгрузки она составляла 33.1 ± 7.4% от исходного уровня
572
НУРУЛЛИН и др.
Относит. интенсивность флуоресценции, ЛТ/Т0
0 10 20 30 40 50
Время, мин
Рис. 2. 1 — изменение интенсивности флуоресценции в интрамуральных нервных волокнах правого предсердия крысы в отсутствие стимуляции в течение 50 мин. 2 — динамика разгрузки БМ1-43 в ходе 50-минутной стимуляции интрамуральных нервных волокон. 3 — динамика разгрузки БМ1-43 в нервно-мышечных соединениях камбаловидной мышцы крысы. Каждая точка показывает среднюю интенсивность флуоресценции интрамуральных нервных волокон, нормализованную на среднюю интенсивность в нуле-
АР левой точке времени — , где Аг — изменение интенсивно
ности флуоресценции в каждой точке, Г0 — интенсивность флуоресценции в нулевой точке. Аппроксимация проведена методом наименьших квадратов.
(п = 13, р < 0.05) (рис. 1б, рис. 2), в то время как в отсутствие стимуляции достоверного изменения интенсивности флуоресценции на протяжении этого отрезка времени не наблюдалось (рис. 2, п = 5, р > 0.1). Необходимо отметить, что такая динамика уменьшения интенсивности флуоресценции в нервных волокнах миокарда при их раздражении
существенно отличается от падения флуоресценции БМ1-43, наблюдаемой в моторных нервных терминалях. Так, в наших экспериментах на кам-баловидной мышце крысы практически полная разгрузка нервных терминалей происходила уже в ходе 10-минутной стимуляции двигательного нерва (рис. 2). Одной из наиболее реальных причин, способных объяснить разную динамику разгрузки БМ1-43 в интрамуральных вегетативных и моторных аксонах, представляется различная интенсивность выделения медиатора в этих объектах (т.е. количество квантов медиатора, освобождающихся на каждый нервный импульс из моторных нервных окончаний, существенно больше, чем из варикозных расширений вегетативных волокон).
Таким образом, можно заключить, что, несмотря на особенности в скорости разгрузки, в интрамуральных нервных волокнах происходит активный экзоцитоз везикул. Это дает основания говорить о функционировании в нервных окончаниях механизма, обеспечивающего квантовое высвобождение медиатора.
Известно, что в предсердном миокарде присутствуют как нервные окончания парасимпатических интрамуральных нейронов, так и волокна симпатических постганглионаров. Следовательно, описанные выше данные могут свидетельствовать о наличии процессов эндо- и экзоцитоза как в холинергических, так и в адренергических нервных волокнах. Эксперименты на десимпати-зированных крысах, у которых симпатическая нервная си
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.