ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 443, № 6, с. 753-756
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.175.82, 57.054
ЭНДОКРИННАЯ ФУНКЦИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ЦЕЛОСТНОГО МОЗГА У КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ: РЕГУЛЯЦИЯ
СЕКРЕЦИИ ПРОЛАКТИНА © 2012 г. Ю. Ю. Сайфетярова, А. Я. Сапронова, академик М. В. Угрюмов
Поступило 24.01.2012 г.
Эндокринная функция дофаминергических (ДА-ергических) нейронов мозга у взрослых животных ограничивается секрецией ДА нейронами аркуатного ядра гипоталамуса в области срединного возвышения, лишенного гемато-энцефаличе-ского барьера (ГЭБ), в гипофизарную портальную систему циркуляции и его участием в ингибитор-ном контроле секреции пролактина лактотрофами передней доли гипофиза [1]. Учитывая небольшой объем портальных сосудов, выделение в них даже небольшого количества ДА позволяет создавать концентрацию, достаточно высокую для физиологического влияния ("физиологически активная концентрация") на клетки-мишени [2]. Однако после дальнейшего слияния портальной крови с гораздо большей по объему периферической кровью происходит многократное разведение ДА до концентрации, в которой он уже не в состоянии влиять на клетки- и органы-мишени [2].
В наших предыдущих исследованиях показано, что мозг с момента образования нейронов в эмбриональном периоде и до формирования ге-мато-энцефалического барьера у незрелорожда-ющихся животных в раннем постнатальном периоде [3—5] функционирует как эндокринный орган, из которого физиологически активные вещества (ФАВ), в частности ДА, поступают в общую систему циркуляции [3—8]. При этом в периферической крови создается физиологически активная концентрация ДА, сопоставимая с таковой в ги-поталамо-гипофизарной портальной циркуляции взрослых животных, при которой ДА инги-бирует секрецию пролактина [2]. Учитывая то, что в этот же период онтогенеза рецепторы к ДА экспрессируются не только в гипофизе, но и в ряде периферических органов [9], можно ожидать, что эндокринное влияние ДА мозгового проис-
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина Российской академии медицинских наук, Москва
хождения не ограничивается гипофизом, как у взрослых животных, а распространяется и на другие периферические клетки- и органы-мишени.
При дальнейшем изучении роли ДА в регуляции секреции пролактина гипофиза в онтогенезе следует иметь в виду два возможных пути влияния — со стороны ДА, выделяющегося, как и у взрослых животных, из гипоталамуса в гипофизарную портальную систему циркуляции, и со стороны ДА, выделяющегося из всего мозга в общую систему циркуляции до формирования ГЭБ.
Цель данной работы — показать, что ДА, поступающий из мозга в общую систему циркуляции до формирования ГЭБ — у крыс до конца первой постнатальной недели, оказывает влияние на секрецию пролактина в передней доле гипофиза. В задачи исследования входило: 1) оценка концентрации пролактина в гипофизе и в плазме периферической крови после полного или частичного выключения дофаминового ингиби-торного контроля секреции пролактина в экспериментах in vivo; 2) оценка прямого влияния экзогенного ДА на выделение пролактина из гипофиза в условиях ex vivo; 3) оценка влияния эндогенного ДА, содержащегося в периферической крови у крыс до становления ГЭБ, на выделение пролактина из гипофиза в условиях ex vivo.
Работа проведена на самцах крыс линии Wistar на третий день постнатального периода развития (П3). В первой серии экспериментов синтез ДА в мозге ингибировали путем стереотаксического введения в боковые желудочки 50 мкг а-метил-паратирозина (аМПТ), ингибитора ключевого фермента синтеза ДА — тирозингидроксилазы [7]. Контрольным животным вводили 0.9%-й NaCl. У одних животных через 4 ч собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. Другим животным через 4 ч после внутрижелу-дочкового введения аМПТ внутрибрюшинно вводили 0.75 мг/кг галоперидола — ингибитора рецепторов к ДА, а через 1.5 ч собирали кровь и выделяли переднюю долю гипофиза. Сбор материала у крыс проводили под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг). Для получения плазмы кровь центрифугировали при температуре 4°С и
Плазма
Гипофиз
Рис. 1. Концентрация пролактина (ПРЛ) в плазме (слева) и в гипофизе (справа) после полного (внутри-желудочковое введение аМПТ и системное введение галоперидола) или частичного (внутрижелудочковое введение аМПТ) ингибирования дофаминового контроля секреции ПРЛ у крыс на третий постнатальный день; в контроле в боковые желудочки мозга вводили 0.9%-й КаС1. * Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.05).
скорости 7000 об/мин в течение 20 мин. Полученные образцы плазмы крови и гипофизов хранили при температуре —70°C до определения пролактина. Всего в этой серии экспериментов было использовано 56 животных от 12 пометов.
Во второй серии экспериментов крыс на П3 декапитировали, выделяли переднюю долю гипофиза, делили ее пополам и переносили в камеры, содержащие 300 мкл холодного Кребс-Рингер-буфера (КРБ) следующего состава (мМ): NaCl — 120, KCl - 4.8, CaCl2 - 2.0, MgSO4 - 1.2, NaHCO3 -25, .D-глюкоза - 10.1, HEPES - 20, аскорбиновая кислота - 0.13 ("Sigma", США). В каждую камеру помещали по 3 половинки гипофизов. После 45 -минутной стабилизации в КРБ при температуре 37°С среду заменяли на 300 мкл свежей и проводили две 10-минутные инкубации для оценки спонтанного выделения пролактина. Затем одни половинки гипофизов переносили на 5 мин в КРБ, содержащий ДА в концентрации 1.5 нг/мл или 0.4 нг/мл, в то время как другие половинки тех же самых гипофизов продолжали инкубировать в КРБ без ДА. Для доказательства специфичности действия экзогенного ДА на секрецию пролактина через рецепторы к ДА на лактотрофах одни половинки гипофизов после предварительной 45-минутной стабилизации и двух 10-минутных инкубаций в КРБ на 5 мин переносили в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА, в то время как другие половинки этих же гипофизов переносили также на 5 мин в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА и 10-10 М га-лоперидол. Полученные образцы инкубационной среды хранили при -70°С до определения про-
лактина. В данной серии экспериментов использовали 105 животных от 17 пометов.
В третьей серии экспериментов после инкубации гипофизов ex vivo с эндогенным ДА, содержащимся в плазме крови неонатальных животных, у крыс под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. В собранную кровь добавляли 0.13 мМ аскорбиновой кислоты (для сохранности эндогенного ДА) и затем ее центрифугировали при 7000 об/мин. Полученную у 48 животных плазму пулировали и до проведения инкубации хранили 1 ч при температуре 4°С. Гипофизы после предварительной 45-минутной стабилизации сначала инкубировали 20 мин при 37°С в КРБ, а затем одни половинки гипофизов в течение 30 мин инкубировали в плазме при 37°С, содержащей 10-10 М галоперидол, в то время как другие половинки тех же гипофизов инкубировали в такой же плазме, но без галоперидола. После этого образцы инкубационной плазмы и сами гипофизы замораживали и хранили при —70° С до определения в них пролактина. Кроме того, по окончании эксперимента образцы инкубационной плазмы отбирали для контроля сохранности эндогенного ДА с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и хранили при температуре —70°С. Всего для проведения данной серии экспериментов было использовано 48 животных от 9 пометов.
Содержание пролактина в передней доле гипофиза, в плазме и в инкубационной среде определяли с помощью иммуноферментного анализа c использованием коммерческих наборов (SPIbio — Rat Prolactin EIA Kit, "Bertin Pharma", Франция).
Для того чтобы оценить влияние ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на периферические органы, в качестве мишени мы использовали лактотрофы гипофиза, а в качестве модели — ингибирование синтеза ДА в мозге с помощью аМПТ [7]. При разработке этой модели нами было показано, что введение в желудочки мозга трехдневных крысят 50 мкг аМПТ — ингибитора синтеза ДА — приводит к снижению концентрации ДА в мозге на 54%, а в общей системе циркуляции — на 74% [7].
В первой серии экспериментов, проведенной в этой работе, было показано, что внутрижелудоч-ковое введение 50 мкг аМПТ приводило к увеличению концентрации пролактина в плазме крови на 32% по сравнению с контролем на фоне неизменного уровня пролактина в гипофизах (рис. 1). Поскольку по нашим данным аМПТ в дозе 50 мкг не полностью ингибирует синтез ДА в мозге, мы оценивали эффект дополнительного ингибирования рецепторов к ДА с помощью галоперидола. После введения аМПТ и галоперидола было отмечено более чем двукратное увеличение концентрации пролактина в плазме крови и достоверное
ЭНДОКРИННАЯ ФУНКЦИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ
755
снижение этого гормона в ткани передней доли гипофиза у животных по сравнению с контролем (рис. 1). Полученные в этих экспериментах in vivo данные свидетельствуют об ингибиторном влиянии ДА мозгового происхождения, содержащегося в периферической крови, на выделение про-лактина лактотрофами передней доли гипофиза у неонатальных крыс. Однако из этих же данных следует, что ДА мозгового происхождения может оказывать влияние на секрецию пролактина как через портальную систему циркуляции, так и через общий кровоток.
Для оценки адекватности нашей гипотезы о развивающемся мозге как об эндокринном органе принципиально важно было определить, обладает ли ДА именно в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови у неона-тальных крыс, ингибирующим влиянием на секрецию пролактина. Для того чтобы ответить на этот вопрос, были проведены эксперименты ex vivo. Ранее нами было показано, что концентрация ДА в плазме крови трехдневных животных составляет 1.9 нг/мл, причем она снижается до 0.4 нг/мл после специфического частичного ингибирования синтеза ДА в мозге [7]. Поэтому для получения доказательства того, что ДА именно мозгового происхождения, содержащийся в периферической крови, может оказывать влияние на секрецию пролактина гипофиза, в экспериментах ex vivo гипофизы трехдневных животных инкубиров
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.