ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 7, с. 905-915
^=ОБЩАЯ
ГЕНЕТИКА
УДК 575.21+575.22+591.557:595.773.4
ЭНДОСИМБИОНТ Wolbachia В ЕВРАЗИЙСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ Drosophila melanogaster
© 2007 г. Ю. Ю. Илинский, И. К. Захаров
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (383) 333-12-78; e-mail: paulee@bionet.nsc.ru
Поступила в редакцию 04.11.2006 г.
Эндосимбиотическая а-протеобактерия Wolbachia широко распространена среди видов членистоногих и нематод-филяриид. Передача бактерии Wolbachia происходит вертикально, трансовариаль-ным путем. Wolbachia является причиной ряда репродуктивных аномалий, вызываемых у вида-хозяина. В работе анализировали изосамочьи линии, созданные на основе сборов мух из природных популяций Drosophila melanogaster, на инфицированность эндосимбионтом Wolbachia. Wolbachia генотипировали по пяти вариабельным маркерам: встройка инсерционной последовательности IS5 в два локуса, кратность повторенности двух минисателлитных повторов и инверсия. В работе использовали 665 изосамочьих линий, выделенных из популяций D. melanogaster Украины, Белоруссии, Молдавии, Кавказа, Средней Азии, Урала, Удмуртии, Алтая, Западной и Восточной Сибири, Дальнего Востока за период с 1974 по 2005 г. Наиболее представлены выборки из популяций Украины, Алтая и Средней Азии. Уровень инфицированности эндосимбионтом Wolbachia популяций D. melanogaster Средней Азии, Алтая и восточно-европейских (Украина, Молдавия, Белоруссия) составил соответственно 64, 56 и 39%. По генотипам цитоплазматической инфекции Wolbachia выявлена гетерогенность для популяций D. melanogaster Кавказа, Средней Азии и Алтая. Наиболее распространен генотип Wolbachia wMel, который обнаруживался во всех исследованных популяциях. Генотип Wolbachia wMelCS2 постоянно присутствует в среднеазиатских и алтайских популяциях и относится к разряду редких в популяциях D. melanogaster Восточно-Европейского региона. Генотип wMelCS Wolbachia единично встречается в популяциях Среднеазиатского и Алтайского регионов, в других регионах не выявлен.
Эндосимбиотическая бактерия ^№о1ЬасЫа своей известностью обязана факту чрезвычайно широкой распространенности среди представителей видов членистоногих и нематод-филяриид и удивительным феноменам манипуляции репродуктивной системой вида-хозяина, которые являются механизмом для распространения инфицированной цитоплазмы в популяции. Передача бактерии происходит строго вертикально в ряду поколений - от матери к потомству (трансовари-ально), что обнаруживает корреляцию в эволюции Wolbachia и мтДНК вида-хозяина [1-7]. Биологическая роль любых репродуктивных аномалий, которые для вида-хозяина и штамма бактерии проявляются специфически, - цитоплаз-матическая несовместимость, гибель самцов на ранней стадии развития, феминизация генетических самцов и партеногенез - заключается в приобретении Wolbachia-инфицированной цитоплазмой репродуктивного преимущества по сравнению с неинфицированной и, как следствие, распространении Wolbachia в популяции.
Фенотипическое проявление инфицированности Wolbachia в форме цитоплазматической несовместимости характерно для многих дрозофилид и в особенности для видов группы melanogaster. Для Drosophila melanogaster обнаруживается слабое проявление цитоплазматической несовместимости.
В природных популяциях D. melanogaster мира Wolbachia встречается повсеместно: средний уровень инфицированности Wolbachia составляет 1/3 часть популяции [8].
Классификация и филогенетические построения для Wolbachia основаны на сравнении, главным образом, нуклеотидных последовательностей гена клеточного деления ftsZ, инициатора клеточного деления dnaA, рибосомального гена 16S rRNA и гена wsp, кодирующего белок клеточной поверхности [9-12]. В последнее время для классификации Wolbachia, инфицирующей D. melanogaster, используют характеристики организации генома, а именно: 1) наличие вставки или отсутствие в двух локусах инсерционного элемента IS5; 2) различия в кратности повторов минисателлитных мотивов по
IS5 WD1310
IS5 WD1310
Рис. 1. Схема трех генотипов Wolbachia ([13] с изменениями), обнаруженных у Drosophila melanogaster в настоящей работе. Генотипы различаются по двум ми-нисателлитным повторам VNTR-141 и VNTR-105 (в скобках приведена кратность мотива), по двум сайтам встройки инсерционной последовательности IS5 и по большой хромосомной инверсии (серым цветом обозначена область инверсии).
двум районам и 3) наличие одной протяженной инверсии (см. рис. 1) [13].
Симбиотическая система D. melanogaster-Wol-bachia представляет интерес по разнообразному спектру вопросов как фундаментального, так и прикладного, методического характера.
В работе проведена оценка степени инфициро-ванности природных популяций D. melanogaster различными генотипами эндосимбионта Wolbachia на огромной территории пространства Евразии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Методом амплификации гена поверхностного белка WSP и гена 16S rRNA анализировались самки Drosophila melanogaster на зараженность эндосим-бионтом Wolbachia [14, 15]. Для анализа использовали самок как непосредственно отловленных из природы, так и из изосамочьих линий, созданных на основе сборов из природных популяций D. melanogaster Евразии. Линии содержатся в фонде лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН. Для выделения ДНК 200 мкл экстрагирующего буфера (трис-HCl (pH 8.0) 10 мМ, EDTA 25 мМ, SDS 0.5%, NaCl 0.1 M, протеиназа К 0.1 мг/мл) добавляли в пробирку с одной самкой, гомогенизировали и инкубировали при 56°С три часа. ДНК переосаждали стандартной методикой и растворяли в 50 мкл бидистиллированной воды. Для ПЦР использовали 1 мкл полученного раствора. ПЦР проводили на амплификаторе Eppendorf. Условия амплификации: 30 циклов; первичная денатурация 95°С 5 мин, затем 95°С 20 с в каждом цикле, элонгация 72°С 1 мин/1 тпн, отжиг праймеров к гену wsp 57°C 1 мин, мультипраймерная реакция wsp-col и 16S rRNA 56°C 1 мин (см. рис. 2), и для остальных реакций 55°С 1 мин. Использованные в работе праймеры приведены в табл. 1. Реакцию проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 1хпЦр-буфер (16 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl (pH 8.8 при 25°C), 0.1% твин-20), 1.5 мМ MgCl2, 0.25 мМ каждого dNTP, 0.3 мМ каждого праймера, 1 ед. Tag-полимеразы.
В случае определения положительного статуса зараженности D. melanogaster эндосимбионтом Wolbachia (наличие ДНК Wolbachia в пробе) устанавливали генотип бактерии по вариабельным локусам, а именно - кратности повторов двух ми-нисателлитных мотивов - VNTR-141 (позиции 89003-90332 относительно генома штамма wMel: AE017196) и VNTR-105 (1080207-1081553), по вставке в два локуса - WD0516/7 (507322-509810) и WD1310 (1251363-1252108) инсерционной последовательности IS5 и по инверсии WD0394-WD0541, где амплифицировались участки возможного разрыва хромосомы (376193-380957, 521923-525975) (см. рис. 3 и 4) [13].
Рис. 2. Электрофоретический спектр ПЦР с праймерами к участку гена цитохромоксидазы С I Drosophila melanogaster (размер ампликона ~500 пн) и гену 16S rRNA Wolbachia (~900 пн). Неинфицированные линии: 3 - w228 (Ижевск 2002), 4 - w125 (Ужгород 1986), 7 - w107 (Магарач 1984), 12 - w175 (Харьков 1983), 14 - w199 (Аскат 2000); инфицированные линии: 2 - w109 (Кишинев 1984), 5 - w97 (Кременчуг 1983), 6 - w213 (Нальчик 1992), 8 - w201 (Пычас 2000), 9 - k15 (Камышановка 2005), 11 - w177 (Харьков 1983), 13 - w214 (Горно-Алтайск 1992), 15 - w209 (Киев 1985). 1 - отрицательный контроль, 10 - маркер 100 пн + 1.5 тпн + 2.0 тпн.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В работе использовали 665 изосамочьих линий из популяций D. melanogaster Евразии - Болгарии, Польши, Германии, Украины, Белоруссии, Мол-
давии, Закавказья, Средней Азии, России (Кавказа, Урала, Удмуртии, Алтая, Западной и Восточной Сибири, Дальнего Востока) за период с 1974 по 2005 г. (табл. 2). Наиболее представлены вы-
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
Амплифицируемый продукт ПЦР-праймер
Участок мтДНК гена цитохромоксидазы C I D. melanogaster COI f 5'-CCA GCT GGA GGA GGA GAT CC-3' COI r 5'-CCA GTA AAT AAT GGG TAT CAG TG-3'
Ген поверхностного белка Wolbachia, WSP 81F 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC-3' 691R 5'-AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA-3'
Ген 16S rRNA Wolbachia 99F 5'-TTG TAG CCT GCT ATG GTA TAA CT-3' 994R 5'-GAA TAG GTA TGA TTT TCA TGT-3'
VNTR-141 Wolbachia F 5'-GGA GTA TTA TTG ATA TGC G-3' R 5'-GAC TAA AGG TTA GTT GCA T-3'
VNTR-105 Wolbachia F 5'-GCA ATT GAA AAT GTG GTG CC-3' R 5'-ATG ACA CCT TAC TTA ACC GTC-3'
IS5-WD0516/7 Wolbachia F 5'-CCA TCA AGG TCT CTT TCA-3' R 5'-TGC AAG GAA AAC TAA ACC AG-3'
IS5-WD1310 Wolbachia F 5'-AGG AGA ACT GGT CTA CGC-3' R 5'-TGT TGC TGA GCT TTG CT-3'
Инверсия WD0394-WD0541 Wolbachia F 5'-GCT TGG AAG GTA TAT GGA C-3' R 5'-GGC TAA AAC TAT AAG TAT TG-3'
F 5'-AAG TCT GTC ACG GTT GAG-3' R 5'-GTA AAA GAT GCA GTA AAG G-3'
ИЛИНСКИИ, ЗАХАРОВ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
~ 1330
Рис. 3. Электрофоретический спектр ампликонов по четырем маркерам трех генотипов Wolbachia wMel, wMelCS2, wMelCS. 2, 6,10,14 - профиль генотипа Wolbachia wMel (линия D. melanogaster - s400 Сочи 2004); 3, 7,11,15 - профиль генотипа Wolbachia wMelCS2 (w75 Гомель 1980); 4,8,12,16 - профиль генотипа Wolbachia wMelCS (921189 Бийск l992); 2-4 - VNTR-105; 6-8 - VNTR-141,10-12 - IS5 WD1310; 14-16 - IS5 WD0516/7; 1, 5, 9, 13, 17 - маркер 100 пн + 1.5 тпн + + 2.0 тпн.
Рис. 4. Амплификация двух участков генома Wolbachia (генотипы wMel, wMelCS2, wMelCS) для выявления возможных разрывов, обусловливающих инверсию WD0394-WD0541. 3,4 - генотип wMel (линия D. melanogaster - s400 Сочи 2004); 5, 6 - генотип wMelCS2 (w75 Гомель 1980); 7, 8 - генотип wMelCS (921189 Бийск 1992); 3, 5, 7 - амплификация с прай-меров к фрагменту локуса WD0394; 4, 6, 8 - амплификация с праймеров к фрагменту локуса WD0541. 1 - маркер 100 пн + 1.5 тпн + 2.0 тпн; 2, 9 - маркер 1 тпн.
борки и отдельные линии из популяций Украины (33%), Алтая (24%) и Средней Азии (24%).
Мы не обнаружили временной динамики ин-фицированности эндосимбионтом Wolbachia изученных природных популяций D. melanogaster. В цело
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.