УДК 612.11-611.438+616-006.04
ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ И НЕОВАСКУЛОГЕНЕЗ
© 2012 г. О. В. Повещенко, А. Ф. Повещенко, В. И. Коненков
Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск E-mail: lymphology@soramn.ru
Установлено, что эндотелиальные прогениторные клетки (endothelial progenitor cells - EPC) играют важную роль в поддержании эндотелиальной целостности и постнатальной неоваскуляризации тканей взрослого организма. Показано, что образование новых сосудов может осуществляться как за счет ангиогенеза, так и путем васкулогенеза из EPC. В обзоре представлены данные о гетерогенности популяции EPC, которые идентифицируются по различным маркерам и обладают разным пролиферативным и функциональным потенциалом. Эти клетки не только увеличивают неоваску-ляризацию тканей после травмы/повреждения, но и являются потенциальными кандидатами для терапевтического ангиогенеза.
Ключевые слова: ангиогенез, васкулогенез, фактор роста эндотелия сосудов, хоминг.
ВВЕДЕНИЕ
Эндотелиальные прогениторные клетки представляют собой уникальную фракцию клеток, которые, подобно эмбриональным ангиобластам, способствуют формированию сосудов в пост-натальном периоде. Процесс дифференцировки эндотелиальных предшественников в эндотелиальные клетки и образование примитивной капиллярной сети назван васкулогенезом.
До недавнего времени считалось, что во взрослом организме неоваскуляризация осуществляется за счет двух процессов: артериогенеза -развития коллатеральных сосудов, и ангиоге-неза - развития новых капилляров путем миграции и пролиферации пресуществующих дифференцированных эндотелиальных клеток [8]. Но Асахара в 1997 г. [3] показал, что популяция гемопоэтических CD34+ клеток костномозгового происхождения, выделенных из периферической крови человека, способна дифференцироваться in vitro в клетки с фенотипом зрелых эндотелиальных клеток и приводит к реваскуляризации in vivo в ответ на острую тканевую ишемию. Таким образом, во взрослом организме образование новых сосудов может происходить не только путем ангиогенеза, но и васкулогенеза. В 1998 г. Ши [50] впервые выделил из циркулирующих моно-нуклеарных клеток популяцию незрелых эндо-телиальных клеток. Клетки-предшественники,
участвующие в васкулогенезе у взрослых, были названы эндотелиальными прогениторными клетками (endothelial progenitor cells - EPC). Для идентификации EPC из периферической крови Асахара использовал 2 маркера: маркер гемопоэтических предшественников - CD34 и зрелых эндотелиальных клеток - рецептор фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor receptor-2 - VEGFR-2/kinase insert domain -containing receptor - KDR).
С этих отправных работ началось исследование и определение роли циркулирующих EPC в восстановлении поврежденного эндотелия сосудов и ангиогенеза при опухолевом росте. В экспериментальных моделях ишемии миокарда и нижних конечностей на грызунах показано, что EPC способствуют формированию сосудистой сети в поврежденных тканях [14, 44, 67]. Проводимые клинические исследования показали эффективность клеток костного мозга и EPC периферической крови при ишемических заболеваниях [31, 35, 46, 47].
Кроме того, циркулирующие EPC представляют интерес как диагностический и прогностический биомаркер сердечно-сосудистых заболеваний. Пониженный уровень циркулирующих EPC коррелирует с повышенным риском возникновения ишемической болезни сердца и инфаркта [10, 15, 63]. Показано, что у пациентов с гипертонической болезнью уровень систолического давления
негативно коррелирует с количеством EPC [62], у пациентов с диабетом и инсультом количество EPC также снижено [6].
ХАРАКТЕРИСТИКА И ИСТОЧНИКИ EPC
EPC в начале были выделены из костного мозга и периферической крови и характеризовались экспрессией поверхностных маркеров CD34, и/ или CD133, и VEGFR-2. CD34, маркер гемопоэ-тических клеток, используется для идентификации и эндотелиальных прогениторных клеток, поскольку оба типа клеток происходят из общего предшественника-гемангиобласта [42]. CD34 экспрессируется в незначительном количестве и на зрелых эндотелиальных клетках. Другим наиболее примитивным маркером гемопоэтических клеток является CD 133, который, в отличие от CD34, экспрессируется только на незрелых типах клеток [16]. VEGFR-2 является маркером зрелых эндотелиальных клеток, опосредует сигнал фактора роста эндотелия сосудов. Только 0.1-0.4% CD34+ клеток костного мозга и периферической крови после мобилизации гранулоцитарным ко-лониестимулирующим фактором (Granulocyte Colony Stimulating Factor - G-CSF) экспресси-руют маркер VEGFR-2 [71]. Некоторые авторы выделяют две субпопуляции EPC: более примитивные CD133+CD34+VEGFR-2+ и более зрелые CD133CD34+VEGFR-2+ [16].
Таким образом, эндотелиальные предшественники костномозгового происхождения являются главными кандидатами на поддержание и восстановление сосудов и характеризуются триадой маркеров CD34, CD133 и VEGFR-2. Но периферическая кровь содержит эндотелиальные прогениторные клетки и миелоидного (моноци-тарного) происхождения, не экспрессирующие маркер гемопоэтических клеток CD34 и имеющие фенотип CD14+CD34-, которые также могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro и образовывать сосудистую сеть in vivo [5].
CD14+, так же как и CD14- клетки (известные также как ранне- и позднерастущие EPC), выделенные из периферической крови и культивированные in vitro, в процессе дифференцировки в зрелые эндотелиальные клетки экспрессируют одинаковые маркеры, обладают идентичными функциональными характеристиками и способствуют неоваскуляризации в моделях in vivo [2.56]. Таким образом, EPC не рестриктированны по моноцитарному CD14 маркеру, но обязательным условием функциональной активности и CD14+, и CD14- клеток является экспрессия эндотелиаль-ного маркера VEGFR-2.
Ранне- и позднерастущие EPC отличаются пролиферативным потенциалом. Ранние EPC, полученные из моноцитарных клеток, имеют низкую пролиферативную активность и экспрес-сируют маркеры, характерные для зрелых эндоте-лиальных клеток. Хотя эти клетки могут встраиваться в монослой эндотелия, они недостаточно способствуют перфузии in vivo. Альтернативой служат поздние EPC, которые обладают большим пролиферативным потенциалом и могут в значительной степени поддерживаться в культуре. Они играют ключевую роль в неоангиогенезе in vivo и являются сосудоформирующими EPC [66]. Последние исследования идентифицируют эти клетки как CD34+CD45- прогениторы [54]. CD14+ клетки дают начало ранним EPC, тогда как поздние EPC развиваются исключительно из CD14-субпопуляции [20, 73].
Для получения ранних и поздних EPC описаны 2 способа их выделения из периферической крови [66]. При первом способе изолированные мононуклеарные клетки культивируют в посуде, обработанной фибронектином в присутствии факторов роста, что приводит к формированию эндотелиальных колоний (колониеобразующие единицы эндотелиальных клеток) через 5-7 дней. В другом случае оценивается колониеобразование на обработанном коллагеном пластике через 1421 день культивирования. И CD14+, и CD14- клетки периферической крови при культивировании in vitro в среде, обогащенной ростовыми факторами, экспрессируют маркеры зрелых эндотелиаль-ных клеток (VEGF-R2, vWF-von Willebrand factor, eNOS-endothelial nitric oxide synthase). Функциональная способность EPC, наряду с экспрессией поверхностных маркеров и способностью формировать сосудистую сеть, оценивается по кло-ногенному потенциалу.
Введение EPC в моделях in vivo иммунокомпро-метированным мышам может значительно улучшать перфузию, но только небольшое число EPC, как было показано, может встраиваться в ткани и образовывать новые капилляры [19, 70]. Следовательно, EPC способны выделять проангиогенные факторы, а те - оказывать паракринное воздействие. Эта вспомогательная функция EPC может быть ключевой в обеспечении выживания ткане-резидентных клеток и усиления формирования сосудистой сети и тканевой репарации. Ранние EPC продуцируют более высокий уровень факторов роста по сравнению с поздними, что также говорит о различной роли этих двух фенотипов клеток в неоваскуляризации [55]. Поэтому, хотя ранние EPC имеют низкий уровень пролиферации, они оказывают действие на ангиогенез сек-
Эндотелиальная прогениторная
Эндотелиальная прогениторная клетка (миелоидный субттш)
Эндотелиальные маркеры +
Зрелая эндотелиальная клетка
Рис. 1. Дифференцировка эндотелиальных прогениторных клеток.
Регионарная стволовая клетка
рецией ангиогенных факторов роста, стимулируя пролиферацию поздних EPC или резидентных зрелых эндотелиальных клеток.
Имеются и спорные сообщения о том, что популяция CD34+CD133+VEGFR-2+ клеток не является EPC, а относится к примитивным гемопоэти-ческим прогениторам [9].
Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнения, что не только костный мозг может выделять прогениторные клетки, которые могут дифференцироваться в EPC. Имеются данные о том, что большая часть циркулирующих в крови EPC (около 70%) не костномозгового происхождения [26, 28, 71]. К альтернативным EPC относятся мезенхимальные стромальные клетки, тканевые резидентные клетки. Показано, что мононуклеар-ные клетки селезенки, селектированные в ростовой среде с эндотелиальными факторами роста, приобретают эндотелиальный фенотип, формируют первичную сосудистую сеть in vitro и повышают реэндотелизацию в эксперименте [60, 61]. Внутривенная трансфузия EPC селезенки сплен-эктомированным животным приводит к хомингу этих клеток в область повреждения. В кишечнике и печени также содержится определенное количество тканерезидентных прогениторных кле-
ток [2]. Кроме того, в жировой ткани находятся стволовые клетки, которые секретируют большой спектр проангиогенных факторов роста и могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro, а также способствовать неоваскуляризации in vivo [22, 49, 74]. EPC обнаружены и в адвен-тициальном слое сосудистой стенки взрослого организма [30, 69].
Таким образом, EPC являются гетерогенной популяцией. И фенотип, и функциональная принадлежность
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.