ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 438, № 6, с. 838-841
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.151.4:591.3:612.273:612.821.2:612.825
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АМИЛОИД-ДЕГРАДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НЕПРИЛИЗИНА ПРИВОДИТ К ИЗМЕНЕНИЮ КОГНИТИВНЫХ ФУНКЦИЙ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2011 г. И. А. Журавин, Н. М. Дубровская, Д. С. Васильев, Н. Л. Туманова, Н. Н. Наливаева
Представлено академиком М.В. Угрюмовым 11.02.2011 г. Поступило 24.03.2011 г.
Патогенез болезни Альцгеймера, одной из самых распространенных и неизлечимых деменций человека, связывают с накоплением в головном мозге агрегатов Р-амилоидного пептида (АР), вызывающим развитие нейродегенеративных процессов, природа и механизмы которых до конца не ясны, но интенсивно изучаются. Так, установлено, что в ткани мозга присутствует ряд амило-ид-деградирующих ферментов, способных контролировать уровень содержания Ар. Одним из основных амилоид-деградирующих ферментов является металлопептидаза неприлизин (НЕП). Недавно также было показано, что в нервных клетках существует механизм регуляции экспрессии НЕП (по принципу обратной связи) цито-плазматическим фрагментом белка — предшественника амилоидного пептида (АРР). Этот фрагмент, именуемый А1СЭ, образуется в результате действия на молекулу АРР Р- и у-секретаз, приводящего также к образованию Ар [1, 2]. В комплексе с другими факторами, повышающими его стабильность, А1СЭ обладает транскрипционной активностью и является необходимым для активации гена НЕП. С другой стороны, репрессия гена НЕП в нервных клетках (в частности, в культуре клеток нейробластомы 8И-8У5У) осуществляется с помощью гистондеацетилаз, препятствующих связыванию А1СЭ с промотером гена НЕП. Ингибирование гистондеацетилаз (трихостатином или вальпроатом натрия) приводит к повышению уровня экспрессии и активности НЕП [3].
Полученные данные открывают новые перспективы в регуляции активности нейрональных генов путем изменения уровня ацетилирования гистонов при ингибировании гистондеацетилаз.
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
Это, в первую очередь, относится к амилоид-де-градирующим ферментам, активность которых существенно снижается не только с возрастом, но также после гипоксии [4—6]. Так, у крыс после пре-натальной гипоксии мы наблюдали снижение пластичности нервной системы и ухудшение процесса запоминания на фоне уменьшения активности НЕП в корковых структурах мозга [6, 7]. В связи с этим мы предположили, что эти процессы взаимосвязаны и эпигенетическая или фармакологическая регуляции уровня активности НЕП могут приводить к изменению пластичности нервной системы, что в свою очередь влияет на реализацию когнитивных функций.
Для проверки этой гипотезы было проведено изучение эффектов длительного воздействия ингибитора гистондеацетилаз (вальпроата натрия), а также ингибитора неприлизина (фосфорамидо-на) на когнитивные функции и характеристики нейрональной пластичности у крыс в норме или после пренатальной гипоксии.
В работе использовали взрослых (4 мес.) самцов крыс линии Вистар: контрольных (n = 23) и перенесших пренатальную гипоксию (7% О2, 0.2% СО2, 3 ч, 14-й день эмбриогенеза [6, 7], n = 28). Для исследования влияния регуляции активности НЕП на когнитивные функции животных в первой серии экспериментов контрольным (не подвергавшимся пренатальной гипоксии) крысам вводили в кору мозга (0.2 мм от Bregma, L = 3 мм, Н = 1 мм [8]) раствор ингибитора НЕП — фосфо-рамидона (5.9 мкг/мкл, "Sigma", США) или физиологический раствор. Введение проводили при помощи осмотических минипомп ("Alzet", США) в течение четырех недель с постоянной скоростью (0.25 мкл/ч). Во второй серии экспериментов крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, ежедневно в течение трех недель внутри-брюшинно вводили ингибитор гистондеацетилаз — вальпроат натрия (sodium valproate, "Sigma", США, 200 мг/мл физиологического раствора/кг
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
839
% 100
95
90
85
80
+
+
Контроль
Фосфора-мидон
Гипоксия Е14
Гипоксия Е14 и вальпроат
Рис. 1. Результаты тестирования кратковременной памяти в 8-лучевом лабиринте. Ордината — количество правильных побежек. За 100% принято безошибочное однократное посещение всех лучей лабиринта. Слева направо: контроль — взрослые контрольные крысы; фосфорамидон — крысы после введения в головной мозг фосфорами-дона; гипоксия Е14 — крысы, перенесшие гипоксию на 14-й день эмбриогенеза; гипоксия Е14 и вальпроат — крысы, перенесшие пренатальную гипоксию и серию внутрибрюшинных введений вальпроата натрия. Плюс — статистически значимые различия (р < 0.05).
массы крысы) или физиологический раствор в том же объеме. В третьей серии экспериментов исследованы контрольные и перенесшие пренатальную гипоксию животные без введения фармакологических агентов.
Для анализа кратковременной памяти проводили ежедневное однократное тестирование крыс всех групп в течение 14 дней в двухуровневом 8-лучевом радиальном лабиринте [9]. После окончания поведенческих экспериментов часть крыс перфузирова-ли 4%-ным раствором параформальдегида (рН 7.4), извлекали мозг и изготавливали срезы на криоста-те Leica CM 1510S ("Leica Microsystems", Германия). Структуру нервной ткани кортикальных отделов мозга исследовали с помощью светооп-тического метода Ниссля и иммуногистохимиче-ского метода.
Для анализа распределения белка синаптопо-дина использовали кроличьи моноклональные антитела к этому белку (S9567, "Sigma", в разведении 1 : 1000) с последующей их визуализацией с помощью FITC-коньюгированных моноклональ-ных вторичных антител против IgG кролика ("Sigma", разведение 1 : 500). Иммунофлуоресцентное исследование выполняли на микроскопе Leica DMR, оборудованном конфокальным сканером Leica TCS SL ("Leica Microsystems", Германия). Удругой части исследованных крыс флуоресцентным методом [4] проводили определение активности НЕП. Для статистической обработки данных использовали i-критерий Стьюдента или непараметрический критерий Манна—Уитни.
Проведенные исследования показали, что пренатальная гипоксия вызывает у взрослых
крыс нарушение кратковременной памяти в радиальном лабиринте (рис. 1), а также снижение среднего количества синаптоподин-позитивных шипиков в молекулярном слое коры мозга (рис. 2). Эти изменения коррелировали со снижением активности НЕП [6].
Длительное введение фосфорамидона в кору мозга вызывало у взрослых крыс нарушение кратковременной памяти в радиальном лабиринте (рис. 1) и снижение среднего количества синапто-подин-позитивных шипиков в молекулярном слое коры мозга (рис. 2). Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее [6, 8] в экспериментах с многократными (через сутки, 6—8 раз) внутри-мозговыми одиночными введениями ингибиторов НЕП фосфорамидона или тиорфана.
Для восстановления сниженного уровня активности НЕП взрослым крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, проводили внутрибрю-шинно инъекции вальпроата натрия. Обычно после пренатальной гипоксии активность НЕП в коре мозга снижалась в среднем на 40%, а после введения вальпроата натрия уровень активности НЕП увеличивался и статистически достоверно (р < 0.05) не отличался от уровня, наблюдаемого у контрольных животных. У крыс, перенесших гипоксию и введение вальпроата натрия, наблюдали увеличение количества правильных побежек в радиальном лабиринте (рис. 1), а также повышение (на 17.8%) количества лабильных шипиков в коре мозга (рис. 2) по сравнению с животными, перенесшими только пренатальную гипоксию. Необходимо отметить, что ни пренатальная гипоксия, ни введение фосфорамидона или вальпро-
840
ЖУРАВИН и др.
70 60 50 40 30 20 10 0
Рис. 2. Среднее количество лабильных синаптоподин-позитивных шипиков в новой коре контрольных и экспериментальных крыс. Ордината — количество синаптоподин-позитивных шипиков на площади 100 х 100 мкм. На микрофотографиях: верхних — распределение белка синаптоподина в нейропиле молекулярного слоя новой коры мозга крысы; нижних — участок нервной ткани новой коры, окраска по Нисслю. Масштаб: верхние микрофотографии — 40 х 40 мкм, нижние — 350 х 350 мкм. Остальные обозначения, как на рис. 1.
ата натрия не влияют на клеточный состав и ци-тоархитектонику ткани новой коры у взрослых крыс (рис. 2, микрофотографии нижнего ряда).
Введение физиологического раствора не изменяло структуру нервной ткани, активность НЕП и поведение крыс.
Известно, что у крыс в процессе нормального старения или после пренатальной гипоксии происходит снижение активности ряда металлопротеи-наз, осуществляющих катаболизм амилоидного пептида [10]. Выяснено также, что при нарушении катаболизма амилоидного пептида наблюдается снижение экспрессии белков, имеющих пре- и постсинаптическую локализацию, в том числе синаптоподина и синаптофизина [11]. Поскольку актин-ассоциированный белок шипикового аппарата — синаптоподин связывают с обеспечением пластичности нейронных сетей за счет перестройки цитоскелета лабильных шипиков [12, 13], можно предположить, что наблюдаемое нами изменение числа лабильных синаптоподин-пози-тивных шипиков после пренатальной гипоксии, а также при введении фосфорамидона и вальпроата натрия указывает на изменение пластичности нервной ткани, коррелирующее с уровнем активности НЕП. Не исключено, что нарушение формирования нейронных сетей кортикальных отделов мозга является одним из общих механизмов функциональных нарушений как в результате деструктивных пренатальных воздействий, так и в
случае возникновения различных нейродегенера-тивных заболеваний в процессе старения.
Эпигенетическое (с помощью изменения уровня экспрессии соответствующего гена) или фармакологическое повышение активности НЕП может иметь определенный терапевтический эффект при заболеваниях, сопровождающихся снижением уровня экспрессии этого фермента, в частности, при болезни Альцгеймера. Подтверждением этому является тот факт, что после введения ингибитора гистондеа-цетилаз — вальпроата натрия трансгенным мышам, моделирующим болезнь Альцгеймера, у них замедляется развитие когнитивного дефицита и формирование амилоидных депозитов [14].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.