БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 374 - 388
УДК 577.1
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ПЕПТИДЕРГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ СТАРЕНИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
© 2015 В.В. Ашапкин1*, Н.С. Линькова24, В.Х. Хавинсон2,3, Б.Ф. Ванюшин1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; электронная почта: ashapkin@genebee.msu.ru
2 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии,
197110 Санкт-Петербург; факс: +7(812)230-0049, электронная почта: linkova@gerontology.ru
3 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, 191015Санкт-Петербург; факс: +7(812)303-5035, электронная почта: khavinson@gerontology.ru 4 Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 195251 Санкт-Петербург; факс: +7(812)552-6080, электронная почта: linkova@medfiz.ru
Поступила в редакцию 29.07.14 После доработки 13.09.14
При старении культур клеток поджелудочной железы и бронхиального эпителия человека изменяется уровень экспрессии генов, кодирующих специфические для этих клеток факторы транскрипции и другие функционально важные белки. Пептиды KEDW и АЕБЬ оказывают тканеспецифическое действие на экспрессию генов и синтез белков в культурах клеток поджелудочной железы и бронхиального эпителия, соответственно. В данной работе установлено, что с увеличением возраста культуры и под действием пептидов изменяется профиль метилирования промоторных участков генов РБХ1, РАХ6, ЖШ3, ЫКХ2-1, БСОЕ1А1 и это коррелирует с изменениями в уровне экспрессии этих генов. Устойчивые изменения уровней экспрессии генов могут быть обусловлены изменениями в метилировании промоторных областей. Вместе с тем характер метилирования гена РАХ4 в панкреатических клетках и генов ЕОХА1, 8СОЕ3А2, БЕТРА1 в бронхиальных клетках не изменяется с возрастом и при действии пептидов, в то время как уровень их экспрессии изменяется в обоих случаях. Промоторная область гена ЕОХА2 в панкреатических клетках содержит небольшое число метилированных Срв-сайтов, степень метилирования которых изменяется с возрастом и при действии пептида KEDW, однако корреляции между этими изменениями и уровнем экспрессии гена не выявлено. В бронхиальных клетках промоторная область гена ЕОХА2 полностью неметилирована независимо от возраста культуры, в том числе и при действии пептида AEDL. Изменения в характере метилирования промоторных участков могут быть причиной возрастных и индуцированных пептидами изменений в уровнях экспрессии генов РБХ1, РАХ6, ЖШ3 в панкреатических клетках и генов ШКХ2-1 и БСОЕ1А1 в бронхиальных клетках. Экспрессия генов РАХ4, ЕОХА2 в панкреатических клетках и ЕОХА1, ЕОХА2, 8СОЕ3А2, БЕТРА1 в бронхиальных, по-видимому, контролируется иными механизмами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: короткие пептиды, метилирование ДНК, транскрипция, дифференцировка клеток, культура панкреатических клеток, культура бронхиальных клеток, факторы дифференцировки.
Ранее установлено, что при старении клеток поджелудочной железы in vitro происходит изменение экспрессии ряда генов. Большинство этих генов кодируют белки, играющие существенную роль в дифференцировке панкреатичес-
Принятые сокращения: ТНТ — точка начала транскрипции, п.н. — пар нуклеотидов, KEDW — пептид Н^ув-01и-Ар-Тгр-:ЫН2, AEDL - пептид Н-Ак-вЬ-Ар-^и-ОН.
* Адресат для корреспонденции.
ких клеток. Добавление пептида KEDW изменяет экспрессию этих генов и синтез соответствующих белков в «молодых», «зрелых» и «старых» культурах клеток [1]. Кроме того, при стрепто-зотоциновом и аллоксановом сахарном диабете у крыс пептид KEDW снижал уровень глюкозы в крови [2]. У пациентов пожилого возраста с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов пептид KEDW снижал уровень глюкозы в крови натощак и при стандартном глюкозотолерантном
тесте и уменьшал индекс инсулинорезистент-ности [3, 4]. При старении клеток бронхиального эпителия in vitro происходит снижение уровня экспрессии генов NKX2-1 и FOXA1, кодирующих одноименные факторы транскрипции, а также гена SCGB3A2, кодирующего второй секретогло-бин семейства 3A [5]. В то же время уровни экспрессии генов FOXA2 и SCGB1A1 практически не изменяются. Добавление к бронхиальным клеткам пептида AEDL стимулирует экспрессию генов NKX2-1 и SCGB1A1 в «молодых» и «зрелых» культурах клеток и практически не изменяет ее в «старых» культурах. Экспрессия гена SCGB3A2 под действием пептида повышается только в «зрелых» культурах, гена FOXA1 — в «зрелых» и «старых» культурах, а гена FOXA2 — в культурах всех пассажей. Экспрессия генов MUC4, MUC5АС, SFTPA1, кодирующих функционально активные белки бронхиального эпителия, при старении культур прогрессивно уменьшается. Добавление пептида AEDL стимулирует экспрессию SFTPA1 в культурах всех пассажей, MUC4 — в «зрелых» и «старых» культурах, MUC5АС — только в «молодых» культурах. Кроме того, пептид AEDL стимулирует синтез белков, регулирующих процессы дифференцировки, пролиферации и апоптоза в клетках бронхиального эпителия при их старении. Бронхопротек-торные свойства пептида AEDL установлены в моделях острого воспаления легких на животных в результате бактериального повреждения, при хроническом фиброзном воспалительном процессе и сублетальном гипероксическом повреждении легких [6]. Действие пептидов KEDW и AEDL не только избирательно в отношении различных генов, но и тканеспецифично: KEDW действует преимущественно на клетки поджелудочной железы, практически не влияя на клетки бронхиального эпителия, а AEDL — наоборот [6].
Молекулярные механизмы модулирующего действия тетрапептидов на экспрессию генов не выяснены, однако основные закономерности (возрастная и тканевая специфичность, избирательность действия на уровне индивидуальных генов, временные масштабы, включающие множественные клеточные генерации) позволяют предположить, что по своей природе действие пептидов является эпигенетическим. Метилирование цитозиновых остатков ДНК является наиболее изученной эпигенетической модификацией генома, играющей существенную роль в устойчивых изменениях активности генов при дифференцировке и старении клеток у млекопитающих [7—12].
В настоящей работе исследовали характер метилирования генов, экспрессия которых мо-
дулируется пептидами KEDW и ЛЕБЬ, в культурах клеток поджелудочной железы и бронхиального эпителия при их старении, а также возможное влияние тетрапептидов на их метилирование.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы культуры эмбриональных клеток поджелудочной железы человека линии MIA PaCa-2 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) и эмбриональных клеток бронхиального эпителия человека линии FLECH (Институт гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург).
Исследования проводили с клетками 2-го, 7-го, 14-го пассажей, что соответствовало «молодым», «зрелым» и «старым» культурам в соответствии с рекомендациями Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, 2007). Культуры клеток разделяли на экспериментальную и контрольную группы: к первым на каждом пассаже добавляли тетрапеп-тид (KEDW для клеток поджелудочной железы и AEDL для клеток бронхиального эпителия) до конечной концентрации 20 нг/мл, ко вторым — эквивалентный объем физиологического раствора. Клетки поджелудочной железы и бронхиального эпителия культивировали во флаконах площадью 25 см2 («JetBiofil», Китай) в 5 мл ростовой среды и в чашках Петри диаметром 3,5 см в 3 мл питательной среды в СО2-инкубаторе в стандартных условиях (5%-ная CO2, 37°). Клетки поджелудочной железы культивировали в среде ДМЕМ с добавлением L-глутамина («Билот», Россия), 15%-ной сыворотки плодов коровы SC-BIOL («Билот») и 1%-ного раствора пенициллина-стрептомицина. Бронхиальные эпите-лиоциты культивировали в среде иМЕМ с добавлением L-глутамина («Билот»), 10%-ной сыворотки плодов коровы SC-BIOL («Билот») и 1%-ного раствора пенициллина-стрептомицина. Для пересева клеток в соотношении 3 : 1 использовали раствор трипсина-версена.
Выделение ДНК из клеток и ее обработку бисульфитом натрия осуществляли с помощью наборов QIAamp DNA Mini Kit и EpiTect Bisulfite Kit («Qiagen», Германия) по прописям, рекомендуемым фирмой-производителем. Прай-меры для амплификации участков генов на модифицированной бисульфитом геномной ДНК конструировали с помощью on-line сервиса BiSearch [13, 14]. При этом выбирали участки, соответствующие CpG-островкам (CGI) вблизи точки инициации транскрипции или, в случае отсутствия островков, области, непосредственно предшествующей точке инициации транс-
крипции. Амплификацию осуществляли в два этапа со сменой одного из праймеров на более внутренний на втором этапе. В качестве матрицы на втором этапе использовали 2 мкл порции ПЦР-смеси, полученной на первом этапе. ПЦР проводили на приборе ДТ-322 («ДНК-технология», Россия) с помощью набора для амплификации qPCRmix-HS SYBR + ROX («Евроген», Россия). Условия амплификации: 95°—5 мин (денатурация матрицы — активация полимеразы), затем 40 циклов: 95° — 30 с, 52—56° (в зависимости от температуры плавления праймеров) — 30 с, 72° — 45 с, финальная элонгация — 72° — 2 мин. Продукты амплификации фракционировали с помощью электрофореза в 2%-ной агарозе, дискретные продукты ожидаемой длины быстро вырезали при длинноволновом УФ свете (310 нм) и ДНК из них экстрагировали и очищали с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen»). Секвенирование полученных фрагментов проводили в ЦКП «Геном» (http://www. genome-centre.ru/) с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer («Applied Biosystems», США). Визуализацию результатов секвенирования и их экспорт в формате fasta осуществляли с помощью программы Sequence Scanner (http://www.applied-biosystems.com/absite/us/en/home/support/soft-ware-community/free-ab-software.html), а дальнейшую обработку с помощью онлайн-сервиса Meth Tools 2.0 [15]. Степень метилирования индивидуальных частично метилированных сайтов оценивали по соотношению площадей соответствующих пиков цитозина и тимина на четырехцветных электрофореграммах, вы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.