научная статья по теме ЭТИЛЕН СОПРОВОЖДАЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ИЛИ УЧАСТВУЕТ В ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ? Биология

Текст научной статьи на тему «ЭТИЛЕН СОПРОВОЖДАЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ИЛИ УЧАСТВУЕТ В ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ?»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 6, с. 839-846

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 581.1

ЭТИЛЕН СОПРОВОЖДАЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ИЛИ УЧАСТВУЕТ В ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ?

© 2015 г. А. А. Фоменков*, А. В. Носов*, В. Ю. Ракитин*, Е. С. Суханова***, А. С. Мамаева*,

Г. И. Соболькова*, А. М. Носов***, Г. В. Новикова*

*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 19.05.2015 г.

Этилен — один из пяти классических фитогормонов растений — участвует в регуляции многих физиологических процессов. Однако существуют противоречивые сведения о влиянии этилена на рост и деление клеток, хотя показано, что в культуральных сосудах содержание этилена увеличивается до нескольких десятков мкл/л, а продукция этилена связана с периодами активного роста клеток in vitro. Нами выявлена существенная корреляция (r = 0.96) между продукцией этилена и удельной скоростью увеличения сухого веса в суспензионных культурах клеток Ajuga turkestanica, гетеротрофного и миксотрофного штаммов Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris, Euonymus maximoviczianus, Medicago sativa, Panax ginseng, Triticum timopheevii. Для гетеротрофной культуры клеток A. thaliana в логарифмической фазе и в фазе замедления роста показано совпадение максимумов и общего хода кривых, отражающих процессы динамики продукции этилена, доли S-фазных клеток и удельной скорости роста числа клеток. Предобработка исходного инокулята клеток 100 мкл/л этилена приводила через 3 ч их культивирования в свежей питательной среде к удвоению количества S-фазных клеток. Установлено, что экзогенный этилен влияет на количество S-фазных клеток лишь тогда, когда продукция эндогенного этилена мала.

Ключевые слова: Arabidopsis ЛаНапа — Б-фаза — клеточный цикл — культура клеток — пролиферация клеток — рост — продукция этилена

DOI: 10.7868/S0015330315060056

ВВЕДЕНИЕ

С начала XX века, когда впервые было показано нарушение нормального роста растений под действием чрезвычайно низких концентраций газообразного этилена [1], установлен широкий спектр его влияния на растения. Этилен — один из пяти классических фитогормонов — регулирует выход семян из покоя и их прорастание, растяжение клеток, формирование корневых волосков, рост репродуктивных органов и определение пола цветков, старение и опадение листьев и цветков, созревание и опадение плодов, ответы на патогены и абиотические стрессовые факторы [2, 3].

Сокращения: КЦ — клеточный цикл; среда SH — среда Schenk и Hildebrandt; EdU — 5-этинил-2'-дезоксиуридин (от 5-ethy-nyl-2'-deoxyuridine); ERF — отвечающий на этилен фактор транскрипции (от ethylene response factors); PBS — фосфат-но-солевой буфер (от phosphate buffered saline). Адрес для корреспонденции: Носов Александр Владимирович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Факс: 07 (499) 977-80-18; электронная почта: alexv.nosov@mail.ru

Молекулярные механизмы действия этилена были и остаются предметом многих исследований в последние три десятилетия. Основополагающие сведения получены благодаря масштабным генетическим работам с использованием мутантов модельного растения Arabidopsis АаНпа [4, 5]. Идентифицированные ключевые компоненты, участвующие в восприятии и передаче сигнала этилена, позволили предложить "линейный" путь, в соответствии с которым связывание этилена с рецепторными гистидинкиназами изменяет их конформацию, инактивирует комплексы рецепторов с СТЯ1 (Сер/Тре протеинкиназа, подобная протеинкиназам Яа!-семейства). Это приводит к дефосфорилированию белка ЕШ2 (белка подобного №ашр металл-ионному транспортеру), отщеплению его С-концевого домена, который переносится в ядро и инициирует транскрипционный ответ этилен-зависимых генов посредством последовательной активации факто-

ров транскрипции семейств EIN3/EIL1 и ERF [3, 6, 7].

Однако современная картина сигнального пути этилена приобрела важные элементы: интервенцию на разных участках модулей митоген-ак-тивируемых протеинкиназ, вовлеченность проте-асом-зависимой деградации белков сигнального пути и регулируемая этиленом представленность комплексов рецепторов с CTR1 [8—11]. Это определенно указывает на важность для растений тонкой настройки восприятия и передачи сигнала этилена и наличие альтернативных сигнальных путей, что стимулирует дальнейшие исследования в данной области.

Требуют решения и вопросы о роли этилена в регуляции роста и деления клеток. Несмотря на то, что давно сформировалось представление об этилене как ингибиторе растяжения клеток, существует множество примеров стимуляции этиленом роста, что, как правило, определяется концентрацией фитогормона, видом растения и внешними условиями [12, 13].

Нет однозначного понимания значения этилена в контроле пролиферации клеток. С одной стороны, показано ингибирование этиленом репликации ядерной ДНК и деления клеток в проростках гороха [14], а также индукция запрограммированной гибели клеток в определенные периоды клеточного цикла (КЦ) [15]. С другой стороны, этилен индуцирует эндоредупликацию

[16], стимулирует деление стволовых клеток покоящегося центра меристемы корней Arabidopsis

[17], камбиальных клеток тополя [18] и клеток покоящегося центра меристемы корней кукурузы после удаления кончика корня [19].

Безусловно, для исследования влияния каких-либо эффекторов на КЦ растений, в том числе для решения вопроса о месте этилена в регуляции клеточных делений и молекулярных механизмах его взаимодействия с известными компонентами управления КЦ, хорошо подходят экспериментальные объекты с интенсивной пролиферацией клеток, лишенные сложных межтканевых взаимодействий и комплексных онтогенетических программ. Этим условиям удовлетворяют активно растущие суспензионные культуры клеток, которые широко применяются в экспериментальной биологии растений [20].

Важно отметить, что культивируемые in vitro клетки и ткани, в зависимости от вида растения и условий, способны продуцировать этилен, который может накапливаться в культуральных сосудах в концентрации до нескольких десятков мкл/л [21, 22], а физиологические эффекты этилена обнаруживаются и при меньших на два—три порядка концентрациях [1, 2]. Более того, показано, что продукция этилена связана с периодами активного роста культивируемых клеток [21, 23].

Следовательно, высокий уровень этилена должен быть совместим с пролиферацией клеток in vitro. Однако результаты ранних исследований и выводы авторов неоднозначны: от аргументов в пользу того, что этилен является побочным продуктом быстрого роста и не участвует в инициации и поддержании деления клеток растений in vitro, до результатов о разнонаправленном влиянии экзогенного этилена на рост каллусных и суспензионных культур или отсутствии эффектов фитогормона даже при чрезвычайно высокой (~20 мМ) концентрации [21—23].

Таким образом, до сих пор остается открытым вопрос — какова роль этилена в регуляции пролиферации клеток растений in vivo и in vitro? Все это побудило нас вновь вернуться к выяснению связей между ростовыми параметрами культивируемых клеток и продукцией этилена и исследовать влияние экзогенного этилена на количество клеток, находящихся в периоде репликации ядерной ДНК как показателя активного прохождения КЦ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили суспензионные культуры клеток из Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений: (1) Beta vulgaris L., штамм 2n; (2) Triticum ti-mopheevii (Zhuk.) Zhuk.; (3) Panax ginseng C.A. Mey., штамм PgL1 NB; (4) Medicago sativa L.; (5) Dioscorea deltoidea Wall., штамм ДМ-05, линия 3; (6) Ajuga turkestanica (Regel) Briq., линия 1. Кроме того в работе использовали авторские (А.В. Носова и А.А. Фоменкова) штаммы: (7) гетеротрофный штамм Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0) [24]; (8) миксо-трофный штамм A. thaliana и (9) суспензионную культуру клеток Euonymus maximoviczianus Prokh. Культивируемые клетки штаммов 1, 2, 7—9 выращивали в среде Schenk и Hildebrandt (SH) с 3% сахарозы (1.5% для штамма 8), 1 мг/л 2,4-Д и 0.1 мг/л кинетина; культуры клеток штаммов 3—6 выращивали в среде МС с 3% сахарозы, 1 мг/л 2,4-Д и 0.1 мг/л кинетина (для штаммов 4, 5), 2 мг/л НУК и 1 мг/л БАП (3), 1 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ИУК и 0.2 мг/л БАП (штамм 6). Клетки культивировали в стеклянных колбах объемом 250—300 мл, закрытых алюминиевой фольгой и крафт-бума-гой (штамм 4 под ватными пробками), в темноте (штамм 8 постоянно освещали люминесцентными лампами с интенсивностью 200 мкмоль фото-нов/(м2 с)) при температуре 26°С и постоянном перемешивании (120 качаний/мин). Период субкультивирования — 10 дней для штаммов 7, 8; 14 дней для штаммов 1—6 и 20 дней для штамма 9.

Для определения параметров роста клеток суспензий в течение субкультивирования периодически выбирали по три колбы, в которых опреде-

ляли сырой вес клеток и после высушивания при 37°С в течение 3 суток — сухой вес.

Число клеток гетеротрофного штамма A. thaliana оценивали по числу протопластов, для выделения которых смешивали равные объемы суспензии клеток и раствора, содержавшего макросоли SH, 0.8 М сорбита, 8 мМ CaCl2, 25 мМ Mes/KOH (pH 5.7), 2% целлюлазы Onozuka R10 ("Kinki Yakult", Япония), 0.3% пектиназы Mac-erozyme R10 ("Kinki Yakult"), 0.8% гемицеллюла-зы Driselase ("Fluka", США). Протопласты выделяли при 26°С на шейкере (100 качаний/мин) в течение 1.0—1.5 ч. Число протопластов подсчитывали в камере Фукса—Розенталя.

Жизнеспособность оценивали по числу клеток, неокрашенных 0.02% водным раствором Eryth-rosin B ("Sigma-Aldrich", США).

Количество культивируемых клеток A. thaliana, находящихся в S-фазе КЦ, определяли по включению в реплицирующуюся ДНК аналога тими-дина — 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU, "Invit-rogen, Life Technologies", США) по методике, описанной нами ранее [25]. В течение стандартного цикла выращивания или по окончании обработки экзогенным этиленом продолжительностью >1 суток отбирали пробы к

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком