ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 8, с. 967-974
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:597.55
ЭВОЛЮЦИЯ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
© 2014 г. Е. Г. Шайхаев, Л. А. Животовский
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: eshaikhaev@mail.ru, levazh@gmail.com Поступила в редакцию 14.02.2014 г.
Определены нуклеотидные последовательности пяти микросателлитных локусов у десяти видов лососевых рыб. Выявлены заметные различия в структуре одних и тех же микросателлитов у разных видов. Показано, что эволюция микросателлитов — это сложный комплексный процесс, совокупность микросателлитных мутаций, точковых мутаций, а также протяженных делеций и инсерций, приводящих как к образованию микросателлитов, так и к их утрате.
DOI: 10.7868/S0016675814080074
Микросателлиты — это особый класс генетических маркеров, представляющих собой участки ДНК, состоящие из коротких (длиной 1—6 пн), тандемно повторяющихся последовательностей (повторов). Они широко распространены в геномах практически всех организмов [1, 2]. Основным мутационным механизмом, за счет которого происходит изменение количества повторов (на один или несколько), является проскальзывание цепей во время репликации. Темп такого мутирования составляет 10-2—10-5 на локус за поколение, что превышает частоту точковых мутаций — 10-6-10-9 [3, 4].
На сегодняшний день, несмотря на развитие других типов маркеров, таких как 8МР, а также развитие технологий полногеномного секвениро-вания, микросателлиты благодаря простоте гено-типирования, высокому уровню полиморфизма, высокой воспроизводительности в различных лабораториях, относительно низкой стоимости анализа и большому изобилию в геноме не утратили актуальности для различных биологических дисциплин [1, 5].
Несмотря на широкую популярность микросателлитов, некоторые их особенности, например, касающиеся эволюции, изучены недостаточно. Известно, что помимо изменений количества повторов, происходящих в результате проскальзывания цепей во время репликации, внутри микросателлитов также возможны точковые мутации и делеции/инсерции (не кратные количеству нук-леотидов в повторе) [6]. Однако конкретных межвидовых исследований, подробно описывающих эволюцию повторяющихся последовательностей, проведено не так много [7—9].
Данная работа посвящена сравнению структуры одних и тех же микросателлитов у разных видов с целью изучения характера мутационных изменений, которые происходят в них в ходе эволюцион-
ного процесса. В качестве объекта исследования нами были выбраны лососевые рыбы (семейство Salmonidae), эволюционная история которых хорошо известна [10—12]. С помощью различных типов маркеров, как молекулярных, так и морфологических, подробно изучена филогения лососевых рыб. На основании этих данных нами были выявлены различные варианты мутационных событий, происходящих в микросателлитах на протяжении порядка 15—20 млн лет эволюции исследуемых видов лососевых рыб [13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для работы послужили образцы разных видов лососевых рыб, собранные в различных регионах российского Дальнего Востока. В исследование были вовлечены семь видов представителей рода Oncorhynchus (кета, горбуша, нерка, кижуч, чавыча, сима, микижа), а также представители других родов лососевых рыб, в частности, рода Salvelinus — белый голец и кунджа и рода Parahucho — сахалинский таймень.
ДНК выделяли из соединительной ткани грудного плавника рыбы при помощи набора "Diatom DNA prep 200" (ООО "Лаборатория Изоген") согласно прилагаемой инструкции.
Ранее нами были разработаны универсальные праймеры для амплификации восьми микроса-теллитных локусов у всех видов, исследуемых в данной работе. С помощью таких гомологичных праймеров была продемонстрирована возможность применения микросателлитных локусов для идентификации лососевых рыб [14]. Используя эти праймеры, только уже для секвенирова-ния аллелей, нами были определены нуклеотид-ные последовательности локусов 0ne103 [15], 0ne109 [15], 0ММ1037 [16], 0ts102 [17] у всех исследуемых видов. Также с помощью разработан-
ных нами праймеров была определена нуклеотид-ная последовательность локуса Üke3 [18] у всех исследуемых видов, за исключением тайменя [19]. Помимо этого, в базе данных Whole-Genome-Shotgun contigs при помощи NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) были обнаружены последовательности микросателлитных локусов Üne103, Üne109, ÜMM1037, Üke3у атлантического лосося — семги Salmo salar, которые мы также использовали для сравнительного анализа.
Для проведения ПЦР-амплификации использовали набор реагентов "GenPak PCR Core" (ООО "Лаборатория Изоген"), содержащий инги-бированную для "горячего старта" Ta^-ДНК-по-лимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями соответственно 1 ед. акт., 200 мкМ и 2.5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечный объем ПЦР-смеси 20 мкл, конечная концентрация праймеров в реакции 0.1-0.5 мкМ, количество ДНК 20-100 нг. Поли-меразную цепную реакцию проводили в ампли-фикаторе "Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler". Программа амплификации включала в себя следующие стадии: 1) предварительная денатурация при 95°С — 1 мин, 2) 32 цикла: 95°С — 20 с, 56-58°С — 20 с, 74°С — 30 с, 3) заключительный синтез при 74°С — 2 мин.
Для анализа нуклеотидных последовательностей исследуемых локусов проводили разделение их аллелей в 2%-ном агарозном геле в 1х TBE-бу-фере, а также в блоке 6% или 8%-ного неденатури-рующего полиакриламидного геля в 0.5 х ТВЕ. Элюцию вырезанных из геля аллелей (ПЦР-про-дуктов) проводили при помощи набора Diatom DNA elution (ООО "Лаборатория Изоген") согласно прилагаемой инструкции. Реамплифика-цию элюированных ПЦР-продуктов проводили при помощи набора "GenPak PCR Core" (ООО "Лаборатория Изоген").
Очистку и секвенирование аллелей проводили в компаниях ООО "Синтол" и ЦКП ОБН РАН "Генетический полиморфизм".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как отмечалось ранее, исследуемые локусы благодаря различиям в полиморфизме и размерах аллелей могут быть применены для идентификации разных видов лососевых рыб [14]. В таблице приведены данные о полиморфизме исследуемых микросателлитных локусов у разных видов лососевых рыб. Данные исследования показывают, что в зависимости от вида структура одних и тех же локусов также может заметно различаться.
Микросателлитный локус 0ne103
Локус 0ne103 впервые был идентифицирован у нерки [15]. Он имеет сложную прерывистую структуру, в его состав входят два типа тетранук-леотидных повторов — (TCTA)n и (TCAT)n. Однако в зависимости от вида структура данного локуса имеет различия. Например, у сахалинского тайменя локус 0ne103 представлен короткой, простой последовательностью: TCTA(TCAT)3, по которой не наблюдается полиморфизма. Структура (TCTA)n(TCAT)n в целом характеризует три рода: Salmo, Parahucho и Salvelinus. Для представителей рода Oncorhynchus характерна более сложная, прерывистая структура TTTA(TCTA)nT-CAATCTA(TCAT)nTCTT, полиморфизм достигается как за счет (TCTA)n повторов, так и за счет (TCAT)n повторов (рис. 1,6).
Микросателлитный локус 0MM1037
Локус 0MM1037впервые был обнаружен у ми-кижи [16]. Также имеет сложную структуру, состоит из разных типов тетрануклеотидных и динук-леотидных повторов GAAA, GAAG, GGAA, GA. В отличие от локуса 0ne103, по данному локусу у более древних видов, например сахалинского тайменя, наблюдается высокий уровень полиморфизма по сравнению с молодыми видами, такими как горбуша и нерка (таблица). Помимо различий в полиморфизме по количеству повторов данный локус отличается высокой межвидовой изменчивостью, что проявляется уникальностью его структуры у всех исследуемых видов (рис. 1,в).
Микросателлитный локус 0ts102
Данный локус был впервые идентифицирован у чавычи [17] как тетрануклеотидный, со сложной структурой, включающей в себя разные типы тетрануклеотидных повторов (TGCC)n и (TGTC)n. По нему также наблюдаются существенные различия между видами как в уровне полиморфизма, так и в размерах аллелей. Локус 0ts102 у всех видов имеет еще более сложную структуру, чем локус 0MM1037, представлен длинными последовательностями, состоящими из разных типов повторов, которые также уникальны для каждого вида (рис. 2).
Минисателлитный локус 0ke3
Данный локус обнаружен у кеты как миниса-теллит, длина повтора составляет 13 нуклеотидов TCCCTCTCGTCTC [19]. Такую же структуру имеет горбуша. У остальных видов данная повторяющаяся минисателлитная последовательность отсутствует. У нерки, наиболее близкого к кете и горбуше вида, последовательность присутствует в
Аллельное разнообразие исследуемых микросателлитных локусов
и М и н к
Локусы Локусы
Виды Разнообразие Виды Разнообразие
ОпеЮ9 ОпеЮЗ ОММЮ37 ОпеЮ9 ОпеЮЗ ОММЮ37
Кета N=44 А 11 1 3 5 Сима N=44 А 6 9 9 4
Аг 9.5 6.4 2.9 4.5 Аг 4.9 7.4 7.2 3.4
Не 0.85 0.80 0.54 0.56 Не 0.69 0.76 0.75 0.38
Горбуша N=44 А 16 21 4 25 Микижа N=43 А 1 2 10 4
Аг 14.0 18.7 4.0 21.1 Аг 1.0 2.0 9.1 3.8
Не 0.92 0.95 0.65 0.95 Не 0 0.51 0.84 0.45
Нерка Ж=42 А 10 11 3 1 Кунджа N=44 А 4 1 1 8
Аг 8.8 10.1 2.9 1.0 Аг 3.8 1.0 1.0 6.1
Не 0.84 0.84 0.22 0 Не 0.51 0 0 0.67
Кижуч N= 42 А 1 2 2 1 Б.голец N=44 А 1 2 5 31
Аг 1.0 2.0 1.5 1.0 Аг 1.0 1.9 4.5 22.2
Не 0 0.33 0.02 0 Не 0 0.09 0.69 0.94
Чавыча N=44 А 1 3 3 22 Таймень N=22 А 1 1 11 4
Аг 1.0 2.7 2.7 18.1 Аг 1.0 1.0 11.0 4.0
Не 0 0.50 0.20 0.95 Не 0 0 0.87 0.66
£
а
В
5 к
8
►и
0 §
1
н Я Е х й
о %
$
о а
я о о о о и а
Е
X ►и
Е
&1
Примечание. ТУ — количество исследованных образцов, А — наблюдаемое число аллелей, Аг — число аллелей с поправкой на минимальное число образцов, Не — ожидаемая гетерозиготность [14].
чо сл чо
чо о
И
М
и н К
О. keta О. gorbuscha О. пегка О. kisutch О. tshawytscha О. masou О. mykiss S. albus S. leucomaenis P. perryi S. salar
(AGAT)5_16
(AGAT)9_25
(AGAT)s_17
(AGAT)3
(AGAT)4
(AGAT)2_9
(AGAT)3AAAT
(AGAT)3
(AGAT)5_9
(AGAT)3
(AGAT)3
O. keta T П Л (ТС ТЛ) „ TIЛЛ 1С IЛ (TC .AT),, ГСП
О. gorbuscha ТТТА(ТСГЩ„ТСААГСТА(ТСАГ)ПТСТТ
О. пег
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.