ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2014, № 8, с. 963-970
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 579.2
ЕЖЕСУТОЧНАЯ ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И АКТИВНОСТИ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ НА УЧАСТКАХ ЗАЛЕЖНОЙ И ИНТЕНСИВНО ВОЗДЕЛЫВАЕМОЙ ПОЧВЫ
© 2014 г. Н. Р. Эмер1, А. М. Семенов1, В. В. Зеленев1, Н. Б. Зинякова2, Н. В. Костина3, М. В. Голиченков3
1Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1/12 e-mail: emer2005s@gmail.com, amsemenov@list.ru 2Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290, Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 2 3Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинскж горы, 1/12
Поступила в редакцию 25.12.2013 г.
Представлены результаты определения ежедневной динамики (33 дня) численности колониеобра-зующих единиц (КОЕ) азотфиксирующих бактерий и азотфиксирующей активности ацетиленовым методом в серой лесной почве с участков залежи и интенсивно обрабатываемого поля. Выявлена волнообразная динамика численности КОЕ на безазотистой среде в образцах залежи и интенсивно возделываемого поля. Ежедневно определяемые значения актуальной и потенциальной активности азотфиксации в образцах залежи и актуальная активность обрабатываемой почвы находились на уровне чувствительности метода. Потенциальная активность азотфиксации в почве поля имела значимые величины и волнообразный характер динамики. Гармонический анализ ежедневной динамики численности КОЕ и активности азотфиксации выявил статистически значимые гармоники этих биологических характеристик, указывающие на объективный и закономерный характер наблюдаемых волнообразных колебаний. Выявленная динамика и методы ее анализа позволяют получать и изучать характеристики почв, необходимые для разработки новых подходов и методов сравнения биологических свойств почв.
Ключевые слова: волнообразная динамика, КОЕ, азот, актуальная и потенциальная активность, здоровье почвы.
Б01: 10.7868/80032180X14080024
ВВЕДЕНИЕ
Основными составляющими при оценке циркуляции потоков азота в натуральных наземных экосистемах являются природные потоки привнесения азота в экосистему — азотфиксация и потоки выноса (удаления) азота из экосистемы — денитрификация.
Подходы в определении составляющих поступления азота с точки зрения используемых методов — это в большинстве случаев широко распространенный ацетиленовый метод, а с точки зрения продолжительности динамики — редкие, периодические анализы [3]. Обычно изучение микробного сообщества азотфиксирующих бактерий в образцах почвы проводится несколько раз за исследуемый период, который произвольно определяет исследователь. Этот период обычно включает или 1—3 определения при коротком временном промежутке 1—3 недели, или раз в неделю или даже раз в месяц, при более длительных периодах наблюдения — несколько месяцев [5,
13]. Получаемые данные, несомненно, отражают изменения в изучаемом процессе, но, как правило, результаты не позволяют сделать количественных, а тем более прогностических выводов об интересуемом процессе. Для семидесятых годов ХХ в., когда еще не были открыты законы экологии, используемые подходы были безальтернативно приемлемы [9, 10]. Но с открытием законов и концепций в микробной экологии и почвенной микробиологии использование дискретных, нединамических подходов и методов в определении активности процессов, в частности, циркуляции азота в почве, дает неполную, трудно интерпретируемую, ограниченную информацию об изучаемом процессе [6, 9, 15, 20].
В связи с этим, была поставлена задача — изучить динамику процесса азотфиксации в почве методами, позволяющими не только сравнительно и детально охарактеризовать, но и определить количественные, кинетические значения актив -ности процесса, используя закономерности ос-
963
5*
цилляционной динамики, получаемой при ежедневном учете бактерий и активности, осуществляемого ими процесса.
Целью настоящей работы являлось изучение и сравнение длительной ежедневной динамики численности колониеобразующих единиц (КОЕ) азотфиксирующих бактерий и азотфиксирующей активности в почве залежи и интенсивно обрабатываемой почве поля.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Отбор проб и подготовка почвы. Образцы серой лесной почвы отобрали в ноябре 2012 г. п. Заокский Тульской обл., 1-й Рудневский проезд, 13, с интенсивно возделываемого картофельного поля учебного центра Миттлайдера. Система Миттлайдера характеризуется интенсивным возделыванием почвы с внесением минеральных удобрений в количестве N180P180K180 ежегодно в виде азофоски и аммиачной селитры [1]. Продолжительность интенсивного использования почвы для возделывания культур в учебном центре Миттлайдера — более 20 лет.
В качестве контроля использовали образцы почвы с участка залежи, расположенного на расстоянии около 100 м от поля. Почва была покрыта очень густой, высокой травянистой растительностью, формирующей дерновый слой, который срезали и после отбора почвы возвращали на прежнее место. Травянистая растительность участка залежи была представлена разнотравьем: пырей ползучий (Elytrigia repens), тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium), земляника лесная (Fragaria vesca), лопух большой (Arctium lappa), чертополох поникающий (Carduus nutans). Древесные представители — дуб черешчатый (Quercus robur) и береза повислая (Betula pendula).
Пробы отбирали с глубины 5—20 и 0—20 см для почвы залежи и поля соответственно. Образцы почвы помещали в полиэтиленовые пакеты и транспортировали в лабораторию. Образцы высушивали в сухом проветриваемом помещении при комнатной температуре. Высушенные до воздушно-сухого состояния образцы просеивали через сито с диаметром отверстия 1 мм и освобождали от корешков.
Постановка эксперимента. Работу проводили с образцами почвы, хранившимися четыре месяца в воздушно-сухом состоянии до начала эксперимента.
Определение влажности производили гравиметрически после доведения образцов воздушно-сухой почвы до постоянного веса. В водной вытяжке почвы залежи рН равнялся 5.5, в солевой (KCl) — 4.5, в водной вытяжке почвы поля — 7.6, в солевой — 5.2. В почве залежи содержание С орг равнялось 2.01%, N общ — 114 мг/100 г, N мин — 1.2 мг/100 г, в почве поля С орг — 1.24%, N общ — 92 мг/100 г, N мин - 2.1 мг/100 г [1].
Навески по 5 г готовили одновременно и расфасовывали в стерильные флаконы: 125 х 2 флаконов с образцом почвы залежи для измерения потенциальной и актуальной активности азот-фиксации, 125 х 2 флаконов с образцом обрабатываемой почвы для измерения потенциальной активности и актуальной активности азотфикса-ции, 10 флаконов для определения неспецифического этиленогенеза. За 5 дней до начала измерений активности азотфиксации навески почвы увлажняли стерильной водопроводной водой до 60% ППВ и помещали в эксикаторы.
В образцах почвы поля и залежи определяли актуальную и потенциальную активность азот-фиксации, и число КОЕ. Общая продолжительность эксперимента составила 33 дня.
Определение КОЕ на безазотистой среде. Состав питательной среды Эшби (г): маннит - 20, К2НР04 - 0.2, М§804 • 7Н20 -0.2, ШС1 - 0.2, К2804 - 0.1, СаС03 - 5.0, очищенный агар - 15; вода дистиллированная - 1000 мл, рН 7.0.
Из трех флаконов каждого образца почвы после измерения актуальной активности азотфик-сации готовили почвенные суспензии в соотношении почва : вода - 5 : 45. Перемешивали в течение 5 мин на качалке при 500 об/мин, обрабатывали ультразвуком на приборе Вгатзотс 12 в течение 5 мин с интенсивностью согласно рекомендации для обработки почвенной суспензии. Готовили ряд последовательных десятикратных разведений почвенной суспензии и производили высев каждой суспензии на безазотистую питательную среду в трех повторностях глубинным способом.
Посевы инкубировали в термостате при температуре 28°С без доступа света. Подсчет КОЕ производили на третий и шестой день после высева.
Определение активности азот-фиксации. Для измерения потенциальной активности азотфиксации рандомизированно отбирали 5 флаконов с почвой из каждого варианта. В образцы добавляли глюкозу в количестве 1% от массы образца воздушно-сухой почвы. Флаконы инкубировали 24 ч при температуре 28°С, после чего закрывали резиновыми пробками и внутрь каждого флакона вводили ацетилен. Через 2 ч инкубации с ацетиленом в пробах газовой смеси определяли количество этилена в ацетилене газо-во-хроматографическим методом на хроматографе "Кристалл-2000" (ЗАО СКБ Хроматэк) с пламенно-ионизационным детектором. Характеристики прибора: длина колонки - 1 м, диаметр -3 мм, наполнитель - Рогарак N 80/100, температура колонки - 60°С, температура детектора -160°С, температура испарителя - 100°С, расход газа-носителя - 50 мл/мин, воздуха - 280 мл/мин, водорода - 28 мл/мин. Актуальную активность азот-фиксации измеряли без внесения глюкозы.
3.00E+07 г
2.50E+07 -
„ 2.00E+07 -л
<ч
о
S 1.50E+07 -О
^ 1.00E+07 -
5.00E+06 -
0.10Е+06
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Время, дни
Рис. 1. Ежедневная динамика КОЕ азотфиксаторов в почве залежи (1) и обрабатываемого поля (2).
Активность азотфиксации рассчитывали, не делая пересчет количества образовавшегося этилена в количество фиксированного азота, по формуле:
Аф = ((Сэ - Ск)Кфл)/(Кпр mt),
где Аф — активность азотфиксации без пересчета количества образовавшегося этилена в количество фиксированного азота, выраженная в количестве этилена, выделившегося за 1 ч из 1 г почвы (мкг С2Н4/г в час); Сэ — концентрация этилена, измеренная на хроматографе; Ск — концентрация этилена в ацетилене; Кфл — объем пространства флакона, свободного от почвы (в данном случае — 10 см3); Кпр — объем газовой пробы, взятой для анализа (в данном случае 1 см3); m — масса почвенного образца (в воздушно-сухом состоянии 5 г); t — время инкубации почвы с ацетиленом (2 ч).
Определение дыхательной активности почв залежи и возделываемой проводили на газовом хроматографе ЛХМ-8МД (Московский опытный завод "Хроматограф", Россия) по интенсивности выделения СО2 образцами почв после внесения 1% глюкозы от массы воздушно-сухой почвы (потенциальная активность) и без добавления глюкозы (актуальная активность).
Обработка результатов. Для обработки п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.