ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 475-480
= МЕТОДИКА
УДК 581.1
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПЕРЕНОС Т-ДНК В ПЫЛЬЦУ ЛИЛИИ in vitro
© 2007 г. В. Дун*' **, Й. Ф. Мао*' **, В. Ли**
* Китайский университет океанологии, Циндао, Китай ** Институт биологии клетки, Университет Ланьчжоу, Ланьчжоу, Китай Поступила в редакцию 04.01.2006 г.
Метод прямой трансформации пыльцевых зерен имеет преимущество перед классической процедурой трансформации, поскольку при этом можно избежать некоторых стадий культивирования тканей и последующей регенерации. При агробактериальной трансформации очень важно подобрать оптимальные условия для переноса Т-ДНК в ткань. Пыльцевые зерна лилии Давида (Lilium davidii Duchartre) удалось трансформировать агробактериями только при их прорастании, причем была достигнута очень успешная экспрессия GUS (92.7 ± 2.7%). Для максимальной эффективности трансформации необходимо было оптимизировать среду для культивирования, плотность клеток агро-бактерии, длительность совместного культивирования и сочетание бактериальных штаммом и плазмид. Мы успешно разработали метод для агробактериальной трансформации пыльцевых зерен однодольных растений.
Lilium davidii - Agrobacterium tumefaciens - GUS - трансформация - пыльца
ВВЕДЕНИЕ
Одноклеточные микроспоры растений - это одиночные гаплоидные клетки, которые можно собирать в больших количествах и оплодотворять in vitro. Прямая трансформация пыльцевых зерен - эффективный метод, альтернативный обычной процедуре трансформации, который позволяет избежать таких стадий культивирования ткани, как получение сомаклональных вариаций или регенерация. Для введения генов в зрелые пыльцевые зерна использовали разные способы, например, электропорацию [1, 2] или бомбардировку частицами [3]. Агробактериаль-ную трансформацию также часто применяют в связи с ее относительно высокой эффективностью и простой, недорогой технологией, а также с возможностью переноса крупных фрагментов ДНК с их минимальными перестройками [4-6]. Трансгенные растения, полученные этим методом, стабильно наследуют приобретенные гены [7]; метод эффективен и полезен. Метод вакуум-инфильтрации Agrobacterium tumefaciens (или метод погружения репродуктивных органов (floral-dip)) оказал сильное влияние на генетические и молекулярные исследования. Этот метод принято
Сокращения: АС - ацетосирингон; GUS - Р-глюкуронидаза (P-glucuronidase); ОДбоо - оптическая плотность при 600 нм. Адрес для корреспонденции: Wei Li. Institute of Cell Biology, Lanzhou University, Lanzhou, 730000 China. E-mail: leways@gmail.com
рассматривать как усовершенствование метода трансформации пыльцы [5]. Однако биологический механизм этого процесса еще предстоит выяснить.
Лилии - это однодольные декоративные растения, широко распространенные на рынке продаж. Поэтому легко получить достаточное для исследований количество пыльцы этих растений. Для успешной агробактериальной трансформации необходимо оптимизировать условия для переноса Т-ДНК в ткани растений. Используя GUS в качестве маркера, мы исследовали влияние разных факторов на перенос Т-ДНК в зрелые пыльцевые зерна лилии Давида in vitro. Мы показали, что эффективность агробактериальной трансформации можно повысить, влияя на состав среды, плотность клеток Agrobacterium, длительность совместного культивирования и сочетание штаммов бактерии и плазмид. Добавление ацето-сирингона (АС) и Pluronic F68 не оказало положительного влияния в данной модельной системе.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Растения Lilium davidii Duchartre выращивали в саду Университета Ланьчжоу. В мае, когда растения цвели, мы регулярно собирали пыльцу для дальнейших экспериментов.
Штаммы бактерии и плазмиды. Использовали три штамма Agrobacterium tumefaciens с соответствующими бинарными векторами (таблица):
Использованные штаммы Agrobacterium tumefaciens и различные бинарные векторы [19]
Штамм Положение Ti-плазмида- Бинарный вектор
в хромосоме помощник
EHA101 C58 pEHA101c pIG121Hm
LBA4404 Ach5 pLA4404 pTOK233c
GV3101 C58cl pMP90RK pPCV6NFHGusInt
Примечание. Знак с означает супервирулентный.
EHA101, LBA4404 и GV3101. В Т-ДНК области всех трех бинарных векторов присутствовал ин-трон-содержащий ген uidA, кодирующий GUS, под контролем CaMV 35S промотора, оканчивающийся сигналом полиаденилирования NOS. Этот ген экспрессируется очень активно в однодольных растениях, но не в Agrobacterium. Бактериальные штаммы культивировали при 28°С в течение трех дней на АВ среде, содержавшей 1.25 г/л сахарозы, 1 г/л NH4Cl, 0.3 г/л MgSO4 х 7H2O, 0.15 г/л KCl, 0.01 г/л CaCl2, 2.5 мг/л FeSO4 х 7H2O, 3 г/л K2HPO4, 1.15 г/л NaH2PO4 х H2O и 50 мг/л ка-намицина. Бактерии собирали и суспендировали, разбавляя до желаемой плотности. В качестве контроля использовали дикий тип LBA4404 с разоруженной плазмидой.
Сбор пыльцы и ее совместное культивирование с агробактерией. Пыльцу лилии Давида собирали из недавно завядших пыльников и накапливали для опытов. Ее культивировали совместно с Agrobacterium. Исследовали влияние разных факторов на перенос и экспрессию гена GUS, в том числе состава среды, плотности клеток бактерии, обработки АС и Pluronic F68, длительности совместного культивирования, а также сочетания бактериальных штаммов и плазмид. Если специально не оговорено, пыльцу культивировали с 50 мкл Agrobacterium (EHA101, оптическая плотность при 600 нм (ОД600) = 0.6) в 9-сантиметровых чашках Петри с 20 мл разбавленной в 10 раз МС-среды, содержавшей 2%-ный агар и 10%-ную сахарозу, при 25°С в течение двух дней. Затем пыльцу собирали для анализа активности GUS.
Определение активности GUS. Гистохимическое определение GUS в пыльцевых зернах проводили, как описано Jefferson с соавт. [8]. После совместного культивирования с Agrobacterium пыльцу собирали и промывали три раза дистиллированной водой, затем инкубировали в 1 мМ Х-глюк (5-бром-4-хлор-3-индолилглюкоуронид в 100 мМ Na2HPO4, pH 7.0) в присутствии 0.1% Тритона Х-100, 0.5 мМ K3Fe(CN)6 и 0.1 мМ K4Fe(CN)6. Поскольку пыльца лилии Давида проявляла эндогенную активность GUS, добавляли также 20%-ный метанол, и окрашивание продолжали при 47°С в темноте в течение 24 ч. При этих условиях экспрессия эндогенной GUS оставалась на низком
уровне (1.3 ± 0.1%). Окрашивание GUS останавливали путем отмывания дистиллированной водой с последующим погружением в 70%-ный этанол. Под микроскопом подсчитывали число пыльцевых зерен с голубой окраской и процент таких зерен от их общего числа.
Статистика. Все опыты повторяли не менее трех раз, и в каждой повторности каждого опыта мы использовали около 1000 пыльцевых зерен. Результаты были подвергнуты дисперсионному анализу и определяли наименьшую достоверную разницу (НДР) при P = 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Чтобы выяснить, можно ли трансформировать пыльцу с помощью Agrobacterium, мы культивировали пыльцу лилии Давида совместно с EHA101 штаммом бактерии и ее диким штаммом LBA4404 с обезоруженной плазмидой на 10%-ной MC-среде в течение двух дней. Затем GUS активность была использована как маркер для выявления трансформированных прорастающих пыльцевых зерен. В предварительных опытах мы обнаружили, что пыльца лилии может быть эффективно трансформирована Agrobacterium, содержащей ген GUS в векторной плазмиде, поскольку активность GUS в пыльцевых зернах была высокой после их совместного культивирования с Agrobacterium. Эту активность нельзя объяснить заражением агробактерией, поскольку заражение диким штаммом приводило к гибели пыльцевых зерен или их побурению, но не к голубому окрашиванию, указывающему на активность GUS (рис. 1а). Plegt и Bino [9] показали, что активность GUS может проявиться при развитии мужского гамето-фита и в некоторых ^трансформированных растениях.
Чтобы исключить возможность проявления активности эндогенной GUS в нетрансформиро-ванных пыльцевых зернах, мы использовали в качестве контроля пыльцу, не культивированную совместно с Agrobacterium (рис. 1а, 1). Активность эндогенной GUS при прорастании нетрансформи-рованной пыльцы лилии почти не проявлялась (рис. 16). Однако при определенных условиях была обнаружена сильная экспрессия GUS как в растущих пыльцевых трубках (рис. 1г), так и в начавших прорастать пыльцевых зернах (рис. 1в), но не была обнаружена в непрорастающей пыльце. Это означает, что трансформация пыльцы происходит только при ее прорастании. Клеточная стенка кончика прорастающей пыльцевой трубки может вносить заметный вклад в повышение продуктивности трансформации пыльцы (рис. 1г). Наши результаты ясно показали, что пыльцу лилии Давида можно трансформировать с помощью Agrobacterium.
. *» 12 3 (а) (б)
(в) • , #0 Ф \ (г)
100
к о
гл
Н S
El 50
Рис. 1. Локализация активности GUS в пыльце лилии Давида.
а - прорастающая пыльца: 1 - контроль, свободная прорастающая пыльца, 2 - прорастающая пыльца после ко-культивирования с EHA101 в течение двух дней, 3 - прорастающая пыльца после ко-культиви-рования с Agrobacterium дикого типа в течение двух дней; б - прорастающие нетрансформированные пыльцевые зерна; в - начавшие прорастать трансформированные пыльцевые зерна, обнаруживающие активность GUS; г - растущая пыльцевая трубка, обнаруживающая активность GUS.
Задачей нашей работы было разработать систему агробактериальной трансформации высшего растения, основываясь на использовании пыльцы. Прежде всего, необходимо было подобрать условия, благоприятные для переноса гена. В связи с этим, мы исследовали влияние различных факторов на эффективность агробактери-альной генетической трансформации.
Влияние среды ко-кулътивирования
Состав основной среды для культивирования и концентрация солей важны для определения частоты трансформации однодольных растений. Было показано, что модифицированная среда N6 [10] подходит для ко-культивирования риса. Эта среда была успешно применена и в некоторых других лабораториях. Основная или модифицированная МС-среды также подходят для трансформации риса [11]. Ishida с соавт. [12] сообщили об успешной трансформации незрелых зародышей кукурузы при использовании LS, но не среды N6. Для трансформации пыльцы нужно подд
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.