ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 11, с. 1468-1476
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 575.223:582.282.23
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ "ГЕПТРОНГ" УВЕЛИЧИВАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОСТРЕПЛИКАТИВНОЙ РЕПАРАЦИИ ПРЕДМУТАЦИОННЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ ДНК В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ Saceharomyees eerevisiae
© 2008 г. С. В. Ковальцова1, И. В. Федорова1, Л. М. Грачева1, С. А. Машистов2, В. Г. Королев1
1 Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук,
Ленинградская область, Гатчина 188300; e-mail: lge@omrb.pnpi.spb.ru 2 Фирма "Новофарм", Ташкент 100084 Поступила в редакцию 17.12.2007 г.
Гептронг - лекарственный препарат, изготовленный из чистого деферментированного меда, используется в медицинской практике как гепатопротектор. При изучении генотоксичности этого препарата было показано, что он обладает антимутагенным эффектом. Частота спонтанных мутаций в локусах ADE4-ADE8 и CAN1 была понижена в несколько раз, когда клетки дрожжей высевали на среду с гептронгом при учете частоты мутаций методом упорядоченного посева. Антимутагенный эффект не был обнаружен при измерении частоты спонтанного мутагенеза флуктуационным методом медиан. Гептронг не изменяет выживаемость дрожжевых клеток, но значительно снижает частоту прямых мутаций в локусах ADE4-ADE8, индуцированных УФ- и гамма-лучами и этилметан-сульфонатом. Изучение антимутагенного действия гептронга на уровень УФ-индуцированного мутагенеза у штаммов дрожжей, дефектных по репарационным системам rad2, rad51, rad54, rad59, pmsl, msh2 и hsm3, показало, что у штаммов дикого типа, rad2, rad54, rad59 и hsm3 наблюдался антимутагенный эффект, а у мутантов rad51, pmsl и msh2 он отсутствовал. Это позволяет предположить, что антимутагенное действие гептронга связано со стимуляцией репарации ошибочно спаренных оснований, возникших в процессе работы рекомбинационной ветви посгрепликативной репарации.
Для предотвращения канцерогенеза и других вызываемых мутациями ДНК болезней важно не только избегать факторов риска, но и использовать защитные вещества, снижающие мутагенез или активирующие защитные механизмы клетки. В настоящее время описано много веществ, обладающих антимутагенным и антиканцерогенным действием [1-5]. Антимутагены могут быть подразделены на две группы: десмутагены и биоан-тимутагены [6]. Первые вызывают химическую или биохимическую модификацию мутагенов перед тем как они воздействуют на ДНК клетки. Группа десмутагенов включает редуцирующие агенты, широко распространенные антиоксидан-ты, ингибиторы транскрипционных факторов и др. К биоантимутагенам относятся вещества, влияющие на процессы репарации и репликации ДНК в клетках, подвергнутых воздействию мутагенов. Так, показано, что хлорид кобальта и ванилин понижают частоту мутаций, воздействуя на .есА-контролируемую систему репарации ДНК в клетках E. coli [6]. Танниновая кислота и катехи-нины зеленого чая снижают уровень мутагенеза, стимулируя работу эксцизионной репарации в клетках кишечной палочки, а некоторые из ароматических продуктов, например корица,активи-
зируют свободную от ошибок рекомбинацион-ную ветвь репарации [7]. На культуре клеток человеческой карциномы, дефектных по коррекции ошибочно спаренных оснований ДНК, был обнаружен сильный антимутагенный эффект антиокси-дантов (витамины С, Е, ликофен и др.) [8].
В данной работе мы обнаружили действие лекарственного препарата гептронга, приводящее к снижению спонтанного и индуцированного мутагенеза в клетках дрожжей. Анализ антимутагенного действия гептронга на мутантные штаммы с нарушенными репарационными системами ДНК позволяет предположить, что этот эффект связан с репарацией ошибочно спаренных оснований, возникающих как предмутационные интермедиа-ты в процессе рекомбинационной ветви посгрепликативной репарации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в этой работе, представлены в табл. 1. Штамм 2-ЬМв-3031 был получен разрушением гена КА02 в штамме 5-ЬМв-3031. Штамм 12-БУК-3032 является мейотическим сегрегантом, выделенным при расщеплении гибрида 1Ш-3031 х
Таблица 1. Штаммы дрожжей Saccharomyses cerevisiae, использованные в работе
Штамм Генотип Происхождение
11A-3031 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trpl [9]
11D-3031 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 [9]
LMG-318 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad2::TRP1 [10]
LMG-355 MATaade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad54::URA3 [10]
5-LMG-3031 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 hsm3:: KanR [11]
2-LMG-3031 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 rad2::TRP1 hsm3:: KanR Эта работа
2-IVF-312 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 pms1A [9]
ZS50-30 MATa ade2-GT8 ura3 leu2 trp1 lys1-1 his7-2 msh2::KanMx4 J. Kohli
12-SVK-3032 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 lys1-1 msh2:: KanR Эта работа
IVF-317 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 hsm3-1 pol3-01 [12]
7-PG-301 MATa ura4 him1-1 [13]
HTY237 MATa ade5-1 ura3-52, leu2-3,112 trp1-289 his7-2 rad51::hisG URA3 hisG E.A. Namsaraev
4-SVK-3033 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 his7-2 rad51::URA3 Эта работа
SJR1486 MATa ade2-101 his3A200 ura3(Nhe)-HIS3::intron::cfi2 IR-ura3 (Nhe) lys2ARV::hisG leu2-K lys2A5'lys2A3'-LEU2 rad59::kanGal+ R. Spell
8-SVK-3034 MATa ade2A-248 ura3-160,188 leu2-3,112 trp1 his7-2 lys1-1 rad59:: KanR Эта работа
PG-155 MATa ade2-45 rad2/ MATa ade2-192 rad2 [14]
х 2850-30. Штамм 4-8УК-3033 - мейотический сегре-гант, полученный при расщеплении гибрида 11А-3031 х ИТУ237, а штамм 8-8УК-3034 - при расщеплении гибрида 11А-3031 х 8Ж1486.
Среды. Для выращивания дрожжевых культур использовали среду УБРБ. Среду полного состава использовали в экспериментах по изучению влияния гептронга на частоту прямых мутаций аде-нинзависимости в локусах ЛЬЕ1 и ЛОЕ2, а также на частоту митотической сегрегации и митотиче-ского кроссинговера [15]. Специальную среду с добавлением этанола, исключающую рост мутантов с дыхательной недостаточностью, использовали для оценки влияния гептронга на частоту мутаций в локусах ЛОЕ4-ЛОЕ8 [16]. Для определения частоты спонтанных мутаций устойчивости к канаванину методом упорядоченного посева использовали среду минимального состава [15] с добавлением аминокислот и азотистых оснований, необходимых для роста тестируемых штаммов, и различных концентраций канаванина. Во флук-туационном методе медиан использовали среду того же состава, но обогащенную полным набором аминокислот (за исключением аргинина) и
азотистых оснований и содержащую более высокие концентрации канаванина [12].
Мутагены. Источником УФ-излучения служила лампа БУВ-30Е с мощностью дозы 2.76 Дж/м2с. В качестве источника гамма-лучей использовали установку "Исследователь" с мощностью дозы 60Со 46.5 Гр/мин. Этилметансульфонат (ЭМС) получили от компании 1КС.и8А. Методы обработки клеток дрожжей УФ- и гамма-лучами и ЭМС описаны ранее [13, 16].
Новый фармацевтический препарат гептронг, выпускаемый компанией "НОВОФАРМ", используется в медицине как гепатопротектор. Это лекарство приготовлено из водного раствора де-ферментированного натурального меда.
Мутационные тесты. В экспериментах учитывали три типа мутаций: прямые мутации в генах ЛОЕ1 и ЛОЕ2, прямые мутации в пяти генах, контролирующих биосинтез аденина, АВЕ4-ЛВЕ8 [17] и прямые мутации устойчивости к канаванину СЛЛ'8 САМ*.
В коротком тесте для оценки встречаемости спонтанных мутантов аёе4-аёе8 в популяции клетки дрожжей высевали на среду УБРБ и инку-
Таблица 2. Влияние гептронга на спонтанный мутагенез
Штамм Тестируемая Обработка Частота спонтанных мутаций
мутация упорядоченный посев флуктуационный метод
2-ЬМ0-3031 АВЕ4-АОЕ8 Контроль (5.4 ± 1.2) х10-6
(гай2 Нзт3) Гептронг (0.4 ± 0.1) х10-6
1УБ-317 САМ-5 —► САМК Контроль (4.2 ± 0.2) х10-6 (8.8 ± 1.3) х10-7
(ро13 Нзт3) Гептронг (2.1 ± 0.2) х10-6 (7.4 ± 2.3) х10-7
бировали в течение трех дней. Водную суспензию (105 кл/мл) делили на две части: к одной добавляли гептронг в концентрации 30% от объема суспензии, а к другой - такой же объем воды. Эти суспензии инкубировали в течение 24 ч при интенсивном перемешивании. Затем клетки высевали на среду с этанолом. После семи дней инкубации учитывали число мутантов и число посеянных клеток.
Два способа измерения спонтанного мутагенеза - флуктуационный тест медиан и метод упорядоченного посева использовали для оценки влияния гептронга на частоту спонтанных мутаций. Первый метод позволяет определить частоту спонтанных мутаций, возникающих в процессе роста дрожжевых клеток на среде УБРБ, поэтому суспензию клеток дрожжей высевали на эту среду с гептронгом и без него (контроль). После трех дней инкубации отбирали по 12 отдельных колоний в опыте и контроле, каждую колонию суспензировали в 1 мл воды и высевали на селективную среду, содержащую канаванин в концентрации, при которой не росли канаванинчувствительные клетки. Для определения числа посеянных клеток суспензии разводили и высевали на среду УБРБ. Через 3-4 дня инкубации проводили подсчет канаванинустойчивых колоний и числа посеянных клеток. По специальной формуле определяли частоту спонтанных мутаций канаванин-устойчивости [18].
Метод упорядоченного посева определяет частоту спонтанных мутаций, появляющихся в процессе медленного роста клеток на селективной среде, содержащей более низкие концентрации канаванина, позволяющие клеткам поделиться 810 раз. Клетки инкубировали в 2 мл полной жидкой среды в течение двух дней, затем 1 мл выросшей культуры разводили в 4 мл воды. Специальный репликатор со 150 штырями погружали в эту суспензию и переносили капли на чашки с селективной средой, содержащей канаванин и гептронг, и на контрольные чашки без гептронга.
Канаванинустойчивые мутанты росли быстрее немутантных клеток и выглядели как "бородавки" на фоне ограниченного роста тестируемых культур. После 15 дней инкубации число бородавок и общее число выросших на 150 пятнах клеток было подсчитано. Число выросших клеток определяли после их смыва с нескольких отдельных отпечатков, на которых не появлялись бородавки. Частоту мутаций на клетку на клеточное деление определяли при дел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.