научная статья по теме ФЕНОМЕН ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ОКРАСКИ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫХ БЛОКОВ ХРОМОСОМ В СПОНТАННО ДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТКАХ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРОХРОМА АКРИДИНОВОГО ОРАНЖЕВОГО Биология

Текст научной статьи на тему «ФЕНОМЕН ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ОКРАСКИ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫХ БЛОКОВ ХРОМОСОМ В СПОНТАННО ДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТКАХ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРОХРОМА АКРИДИНОВОГО ОРАНЖЕВОГО»

ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА

УДК 575:576.316:599

ФЕНОМЕН ИЗБИРАТЕЛЬНОМ ОКРАСКИ ПОЛИМОРФНЫХ ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫХ БЛОКОВ ХРОМОСОМ В СПОНТАННО ДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТКАХ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРОХРОМА АКРИДИНОВОГО ОРАНЖЕВОГО

© 2012 г. Т. В. Кузнецова12, И. Л. Трофимова12, |М. С. Ляпуновар, Е. В. Евдокименко2, В. С. Баранов12

Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта Северо-Западного

отделения РАМН, Санкт-Петербург 199034 e-mail: tkuznetzova@mail.ru

2Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, Санкт-Петербург 199034

Поступила в редакцию 01.06.2011 г.

Описан необычный феномен избирательной окраски флуорохромом акридиновым оранжевым (АО) гетерохроматиновых (ГХ) блоков хромосом на препаратах тканей с естественной митотиче-ской активностью (хорион, плацента, эмбриональные органы, костный мозг, семенники), а также культур эмбриональных стволовых клеток. Окраска 0.01%-ным раствором АО в цитратно-фосфат-ном (рН 5.5) или натрий-фосфатном (рН 7.0) буферных растворах позволяет без предварительных обработок образца и препаратов надежно выявлять в спонтанно делящихся клетках полиморфные ГХ блоки хромосом человека (1q12, 9q12, 13p11.2, 14p11.2, 15p11.2, 16q11.2, 21p11.2, 22p11.2, Yq12) и прицентромерные ГХ блоки хромосом мыши по флуоресценции АО в красной области спектра. Обсуждается природа избирательной окраски полиморфных гетерохроматиновых районов хромосом в спонтанно делящихся клетках. Благодаря стабильной воспроизводимости и скорости окраска АО может быть рекомендована в качестве экспресс-метода для выявления полиморфных ГХ блоков хромосом человека в цитогенетической пренатальной диагностике и в онкогематологии.

Для выявления гетерохроматиновых районов (ГХР) хромосом используются различные методы. Наиболее универсальным является метод CBG, при котором окрашиваются центромерные и прицентромерные ГХР всех хромосом, а также ГХ блок на длинном плече Y-хромосомы человека. Различные варианты С-метода с использованием красителя Гимза позволяют визуализировать только активные центромерные районы (Cd-ме-тод) или прицентромерные ГХР отдельных хромосом (Gll-метод) [см. 1, 2]. С помощью флуоро-хромов D287/170, а также DAPI и Hoechst 33258 в сочетании с контрастирующими агентами удается выявлять только полиморфные ГХР хромосом 1, 9, 15, 16, 22 и Y [3].

Флуорохром акридиновый оранжевый (АО) давно применяется в цитогенетике человека. Характерной для АО является метахромазия, обусловленная особенностями его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами (НК), белками и другими биополимерами [4, 5]. В растворе АО может существовать в виде мономера, который интерка-лирует в двухцепочечную НК, окрашивая ее в зеленый цвет, и в виде димера, который электростатически связывается с одноцепочечной НК, придавая ей красный цвет. Известно, что хромосомы на необработанных препаратах окрашиваются АО

относительно монотонно в желто-зеленый цвет. Для получения дифференциальных окрасок с помощью АО, в том числе и избирательной окраски ГХР хромосом, требуются обработки образца или препарата, направленные на денатурацию или деконденсацию хроматина (например, методы ЯРА, ЯВА) [см.1, 5-7].

Ранее нами была обнаружена ярко-красная флуоресценция районов 16дИ и после

окраски АО препаратов, приготовленных прямым методом из ворсинчатого хориона и не подвергавшихся каким-либо дополнительным обработкам [8]. Эта неожиданная находка стимулировала наши исследования особенностей окраски АО хромосом на препаратах, приготовленных различными методами из клеток разного происхождения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препараты метафазных хромосом человека из образцов хориона, плаценты и эмбриональных органов. Материалом служили образцы ворсинчатого хориона (41 образец) и эмбриональных органов (образцы печени, почки, мозга, кишечника, легкого, глаза от 10 эмбрионов человека), полученные после прерывания беременности по медицинским или социальным показаниям в срок 5-12 нед. бе-

451

2*

ременности, а также образцы 12 плацент после кесарева сечения в 36—40 нед. беременности.

"Ускоренный прямой" метод [9]. Ворсины хориона или фрагменты органов помещали в гипотонический раствор с колхицином в конечной концентрации 0.8 мкг/мл. В качестве гипотонии использовали 0.9%-ный цитрат натрия. Для трех образцов в параллельных экспериментах использовали 1%-ный раствор KCl. Затем образцы пре-фиксировали при комнатной температуре и фиксировали этанол—уксусной смесью (3 : 1). Фиксированные образцы размягчали в капле 60%-ной уксусной кислоты непосредственно на предметном стекле, равномерно распределяли суспензию, наносили фиксатор и высушивали.

"Полупрямой" метод [9]. Образцы инкубировали в питательной среде в течение 24—72 ч при 37°С. За 60 мин до фиксации вводили колхицин. Гипотонизировали 20 мин в 0.9%-ном растворе цитрата натрия при комнатной температуре. Префиксацию, фиксацию и приготовление препаратов проводили, как описано выше.

Приготовление препаратов из клеточной суспензии. Суспензию из шести образцов хориона и пяти образцов органов получали путем механической дезагрегации образца ткани до или после фиксации. Фиксированную в этанол-уксусной смеси суспензию наносили на предметное стекло и высушивали.

Препараты из костного мозга и семенников мыши готовили после внутрибрюшинного введения колхицина в концентрации 1 мкг/мл ускоренным прямым методом или из клеточной суспензии как описано выше. В качестве гипотонического раствора использовали 0.55%-ный KCl или 0.9%-ный цитрат натрия, в качестве фиксатора — этанол-уксусную смесь (3 : 1) [10].

Препараты метафазных хромосом человека из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической и пуповинной крови готовили согласно стандартным протоколам [9] из 19 образцов периферической крови от пациентов, направленных для ка-риотипирования, и двух образцов пуповинной крови (кордоцентез с целью пренатальной диагностики хромосомных болезней в 20 и 22 нед. беременности). Для гипотонии использовали 0.55%-ный раствор KCl или 0.9%-ный раствор цитрата натрия. Фиксацию проводили этанол-уксусной смесью (3 : 1). Суспензию наносили на предметные стекла и высушивали.

Препараты хромосом из других тканей. Пилотные исследования проведены на препаратах из пунктата костного мозга от пяти пациентов, страдающих лейкозом (препараты любезно предоставлены И.С. Мартынкевич, НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург), пунктата яичка от пациента с бесплодием (любезно предоставлены И.Д. Федоровой, НИИАГ им. Д.О. От-

та), из двух образцов культивированных клеток амниотической жидкости (любезно предоставлены Ю.А. Логиновой, клиника Ава-Петер, Санкт-Петербург), из трех клеточных линий мезенхи-мальных стволовых клеток костного мозга (МСККМ) (4-й, 6-й и 205-й пассажи) (любезно предоставлены А.В.Воскресенской, НИИАГ им. Д.О. Отта, и Г.Р. Акопян, Институт наследственной патологии, г. Львов, Украина) и одной культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) (любезно предоставлены Н.Б. Рубцовым и Т.В. Карамышевой, Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Препараты были приготовлены согласно стандартным протоколам, информацией о деталях методик мы не располагали.

Хранение препаратов. Все препараты хранились при комнатной температуре или при +4°С от одного дня до двух месяцев.

Окрашивание препаратов флуорохромом АО. На препаратах из цитотрофобласта хориона и лимфоцитов периферической крови были протестированы пять образцов АО (фирмы Sigma, Merck). Из каждой партии готовили по три раствора красителя на натрий-фосфатном (рН 5.0 и 7.0) и цит-ратно-фосфатном Мак-Ильвейна (рН 5.5 и 7.0) буферных растворах в трех концентрациях (0.1, 0.01 и 0.001%).

Маточный раствор красителя и буферные растворы хранили не более месяца в темноте при +4°С.

Процедура окраски описана нами ранее [9]. На необработанный препарат под покровное стекло помещали 0.5 мл раствора, затем смывали покровные стекла проточной водой, препараты высушивали на воздухе и заключали под покровное стекло в соответствующем буферном растворе (см.выше). Время окраски подбиралось эмпирически и варьировало от 5 с до 10 мин.

Анализ препаратов проводили на микроскопе DMRXA (Leica Wetzlar GmbH), оснащенном комплектом светофильтров для АО (I3) и программным обеспечением для ввода и анализа изображений.

На препаратах из образцов хориона анализировали по 12—15 метафазных пластинок, из образцов эмбриональных органов — по 8—15, из образцов плацент — по 5—8, из лимфоцитов и ам-ниоцитов — по 15—20; на препаратах из МСККМ, ЭСК, костного мозга и семенников регистрировали все "читабельные" митозы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проверка условий окраски

Поскольку специфичность взаимодействия АО с компонентами нуклеопротеинового комплекса может зависеть от многих факторов [4, 5, 11—15], мы провели анализ окраски на свежеприготовлен-

ФЕНОМЕН ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ОКРАСКИ

453

ных и хранившихся до двух месяцев препаратах из хориона и лимфоцитов, используя разные партии АО. Следует отметить, что концентрации АО, состав буферных растворов и значения рН, использовавшиеся ранее для получения различных типов дифференциальной окраски хромосом, существенно варьировали [11-16].

Оптимальной мы считали окраску, при которой большинство ядер и метафазных пластинок имели зелено-желтую (до желто-оранжевой) люминесценцию, а ядрышко — красную [4, 12]. При темно-зеленой флуоресценции ядер и хромосом препарат считали недоокрашенным, покровные стекла удаляли и повторно окрашивали при тех же условиях. При анализе перекрашенных препаратов (оранжево-красный цвет ядер и хромосом) время облучения метафазной пластинки увеличивали.

Окраска препаратов из хориона. На препаратах, приготовленных прямым методом из образцов хориона и окрашенных 0.01%-ным раствором АО на натрий-фосфатном буфере (рН 7.0), плечи всех хромосом флуоресцировали в желто-зеленом спектре, а районы 9дЬ, 16дЬ и УдЬ, прицентромерные ГХР и спутники акроцентрических хромосом — в красном (рис. 1, а). Подобный вариант окраски описан ранее для метафазных хромосом из культивированных клеток человека и млекопитающих только после обработок, денатурирующих или деконденсирующих хромат

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком