РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 5, с. 567-570
^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 577.2.017.3:[539.1.04+535-31]
ФЕНОМЕН УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК КЛЕТОК СИСТЕМЫ КРОВИ В ПЕРВОМ ПОКОЛЕНИИ ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧАЕМЫХ МЫШЕЙ
© 2007 г. И. О. Велегжанинов1, А. А. Москалев1, А. Н. Осипов2*
1Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар 2Институт общей генетики им. НИ. Вавилова РАН, Москва
Впервые экспериментально показано, что хроническое воздействие низкоинтенсивного у-излуче-ния (0.04 мГр/ч) приводит к уменьшению уровня однонитевых разрывов ДНК клеток селезенки в 2.3 раза (р < 0.001), лейкоцитов крови в 6.1 раз (р < 0.01), уменьшению частоты апоптотических клеток в 1.3 раза (р < 0.05) и увеличению относительной массы селезенки в 1.2 раза (р < 0.001) у потомков мышей (Б1) линии СВА, полученных от хронически облученных родителей и подвергавшихся низкоинтенсивному воздействию радиации в течение эмбрионального и постэмбрионального периодов. Выдвинуто предположение о более компактной структуре хроматина клеток системы крови у особей первого поколения хронически облучаемых мышей.
Однонитевые разрывы ДНК, апоптоз, метод ДНК-комет, клетки селезенки, хроническое облучение, мыши.
Эволюция живых организмов на Земле протекала в условиях постоянного воздействия ионизирующего излучения (ИИ). Интенсивность, компонентный и спектральный состав ИИ значительно менялся в различные геологические периоды, но в исторически обозримом прошлом человечества радиационный фон значительно не менялся. Ситуация резко изменилась в XX веке, когда испытания и использование ядерного оружия, аварии на атомных станциях и предприятиях ядерно-промышленного комплекса привели к радиоактивному загрязнению значительных территорий и соответственно увеличению степени воздействия ИИ на человека и биоту. В связи с вышеизложенным, изучение закономерностей формирования биологических эффектов воздействия ИИ на живые организмы в течение нескольких поколений является одной из наиболее актуальных задач радиационной биологии.
Исследования популяций мышей и полевок, обитающих на загрязненных радионуклидами территориях в течение нескольких десятков лет, показали, что у животных наблюдается увеличение количества ДНК-белковых сшивок в клетках селезенки и лейкоцитах крови [1, 2], а также уменьшение уровня однонитевых разрывов ДНК в клетках селезенки [2]. Отмечено уменьшение чувствительности клеток селезенки рыжих полевок к воздействию перекиси водорода [2]. Однако
* Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ул. Губкина, 3, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; тел.: (495) 132-66-27; e-mail: andreyan.osipov@mail.ru.
трудности с оценкой дозовых нагрузок, наличие сопутствующих факторов химической природы и возможное влияние изменений численности популяций не позволяют сделать однозначное заключение о радиогенном характере наблюдаемых изменений.
В настоящей работе впервые в лабораторных условиях была произведена оценка уровня однонитевых разрывов ДНК и частоты апоптотических клеток селезенки и лейкоцитов крови у потомков мышей ^1), полученных от хронически облученных самцов и самок и подвергавшихся низкоинтенсивному воздействию радиации в течение эмбрионального и постэмбрионального периода.
Результаты исследований позволяют получить информацию о возможном направлении микроэволюционного процесса живых организмов в условиях увеличения радиационного фона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
У мышей, подвергшихся хроническому воздействию у-излучения в эмбриональный и постэмбриональный периоды развития, и являющихся потомками (I поколение) облученных родителей исследовано: количество однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК клеток селезенки и лейкоцитов периферической крови, частота апоптоза клеток селезенки, и относительный вес селезенки. В эксперименте использовали мышей линии СВА.
СКИ, усл. ед.
0.5 г
0.4 0.3 0.2 0.1
0
□ контроль
□ облучение
*** _
Клетки селезенки
Лейкоциты
Уровень однонитевых разрывов ДНК клеток селезенки и лейкоцитов периферической крови у мышей, подвергшихся низкоинтенсивному воздействию у-излуче-ния в течение эмбрионального и постэмбрионального периодов онтогенеза, и являющихся потомками (I поколение) хронически облучаемых родителей. СКИ - средний комет-индекс. ** - различие с контролем достоверно прир < 0.01, *** - прир < 0.001.
Животных поставили на размножение в количестве 5 пар в обычные условия вивария и 5 пар в условия постоянного воздействия низкоинтенсивного у-излучения с мощностью дозы 0.04 мГр/ч. Исследовали поколение, полученное от этих пар и получившее дозу 1.9 ± 0.2 сГр в период эмбрионального развития и 5.8 ± 0.6 сГр в постэмбриональный период (2 мес со дня рождения). К моменту зачатия анализируемого помета мыши-родители получили дозу 7.4 ± 1.6 сГр, а к моменту рождения 9.3 ± 1.8 сГр. Дополнительно исследовали мышей нулевого поколения, облучавшиеся в течение всего эксперимента (315 сут) с возраста 45 сут и накопивших дозу 30 ± 3 сГр.
Анализ изменений количества однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК проводили методом электрофореза ДНК в геле (метод ДНК-комет, щелочная версия (рН > 13)) [3]. Анализировали клетки селезенки и лейкоциты периферической крови. Анализ ДНК-комет проводили при помощи флуоресцентного микроскопа Микмед-2, вариант 11 (ЛОМО, Россия). Для каждого препарата селезенки подсчитывали по 200 клеток (для крови по 100). В зависимости от формы кометы относили к одному из пяти классов от 0 до 4 (0 при отсутствии повреждений, 4 при максимальном повреждении). Данный метод визуальной оценки был предложен Collins et al. [4] и считается приемлемым методом для исследования повреждений ДНК [5]. Средний комет-индекс СКИ рассчитывали по формуле:
СКИ = (1«! + 2n2 + 3n3 + 4n4)/£,
где n1-n4 - число комет в категориях 1-4, и £ -сумма всех подсчитанных комет, включая число комет в категории 0 [6].
Анализ частоты апоптотических клеток проводили методом диффузии ДНК в геле [7], подсчитывали по 1000 клеток с каждого препарата, результат выражали в промилях.
Статистическую обработку данных проводили с помощью ¿-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖЕНИЕ
Результаты наших исследований показали, что у животных, которые были зачаты от хронически облученных родителей (7.4 ± 1.6 сГр) и облучались в течение эмбрионального (1.9 ± 0.2 сГр) и постэмбрионального (5.8 ± 0.6 сГр) периодов развития отмечается статистически достоверное (р < < 0.01) уменьшение уровня однонитевых разрывов ДНК клеток селезенки и лейкоцитов крови (рис. 1).
Исследования первого поколения хронически облучаемых мышей ранее не проводились, однако результаты исследований мышей линии С57Б1/6, подвергавшимся воздействию низкоинтенсивного у-излучения с близкой мощностью дозы (0.17 сГр/сут), показали, что на 30-е сут облучения (5.1 сГр) у животных отмечается достоверное уменьшение количества однонитевых разрывов ДНК клеток селезенки, регистрируемое методом контролируемой щелочной денатурации ДНК [8]. Одновременно у тех же животных отмечалось увеличение количества ДНК-белковых сшивок в клетках селезенки. Предполагалось, что увеличение количества прочных связей ДНК-белок препятствует щелочной денатурации ДНК и тем самым уменьшает регистрируемое количество однонитевых разрывов ДНК [8]. Однако природа увеличения количества прочных связей ДНК-белок при воздействии ИИ в малых дозах до сих пор не ясна. Не исключено, что увеличение количества прочных связей ДНК-белок одновременно с уменьшением количества разрывов ДНК является отражением общей ком-пактизации хроматина исследуемых клеток. Известно, что степень компактизации хроматина является одним из основных факторов, определяющих клеточную радиочувствительность [9]. Белки хроматина лимитируют доступ свободных радикалов к ДНК, уменьшая тем самым количество индуцируемых свободными радикалами повреждений ДНК. В работе Алипова и др. [10] было аргументировано показано, что радиорезистентные потомки облученных фибробластов джунгарского хомяка линии DH-TK характеризуются более компактной структурой хроматина по сравнению с материнскими клетками.
Более компактная структура хроматина должна защищать клетки не только от воздействия ИИ, но и от воздействия свободных радикалов, образующихся вследствие нормального клеточ-
ФЕНОМЕН УМЕНЬШЕНИЯ УРОВНЯ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ ДНК КЛЕТОК
5e9
Таблица 1. Влияние хронического низкоинтенсивного у-излучения на частоту апоптотических клеток селезенки и относительную массу селезенки мышей первого поколения
Экспери-
Показатель ментальная N X ± m-
группа
Апоптотические Контроль 16 12.37 ± 1.221
клетки селезенки, 14 9.51 ± 1.056*
% Облучение
Относительная Контроль 16 0.279 ± 0.009
масса селезенки, 16 0.355 ± 0.015**
% Облучение
* Различие с контролем достоверно прир < 0.05. ** р < 0.001, N - число животных в группе, X ± т- - среднее ± ± ошибка средней.
Таблица 2. Влияние хронического воздействия низкоинтенсивного у-излучения (накопленная доза 30 ± 3 сГр) на уровень однонитевых разрывов ДНК и частоту апоптотических клеток селезенки мышей нулевого поколения
Показатель
Средний комет-ин-декс, усл. ед. Апоптотические
клетки селеленки, %
Относительная
масса селезенки,
%
Экспери-
ментальная N X ± s'x
группа
Контроль 8 0.276 ± 0.039
Облучение 8 0.365 ± 0.042
Контроль 8 11.62 ± 1.451
Облучение 8 8.87 ± 1.288
Контроль 8 0.261 ± 0.016
Облучение 8 0.321 ± 0.013*
* Различие со сравниваемой группой достоверно прир < 0.05. N - число животных в группе, X ± т- - среднее ± ошибка средней.
ного метаболизма кислорода. Как следствие можно наблюдать уменьшение количества повреждений ДНК и частоты апоптотической элиминации поврежденных клеток. Действительно, у облученных мышей первого поколения наблюдается достоверное (р < 0.05) уменьшение частоты апоптотических клеток по сравнению с необлучен-ным контролем (табл. 1).
У облученных мышей первого поколения было отмечено также и достоверное (р < 0.001) увеличение относительной массы селезенки по сравнению с контролем (табл. 1). Возможно, что для поддержания компромисса
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.