ЭЛЕКТРОХИМИЯ, 2004, том 40, № 9, с. 1111-1119
УДК 541.138
ФЕНОТИАЗИНОВЫЕ КРАСИТЕЛИ -ЭФФЕКТИВНЫЕ ИСКУССТВЕННЫЕ АКЦЕПТОРЫ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В РЕАКЦИИ БИОЭЛЕКТРООКИСЛЕНИЯ МОНОАМИНОВ
© 2004 г. Г. П. Шумакович, Л. Г. Дубова*, Н. А. Вызова, А. И. Ярополов1, С. О. Бачурин*
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва, Россия *Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка, Московская обл., Россия
Поступила в редакцию 23.01.2004 г.
Изучены каталитические свойства моноаминоксидазы (МАО) в гомогенной реакции окисления и в гетерогенной реакции биоэлектрокаталитического окисления бензиламина (БА) искусственными акцепторами электронов (ИАЭ) - производными фенотиазина и феноксазина. Показано, что эффективность электроферментативного катализа с участием метиленового голубого и МАО, иммобилизованной на электроде, сравнима с эффективностью гомогенного ферментативного катализа. Установлено, что метиленовый голубой и толуидиновый синий, иммобилизованные в полимерной пленке полианиона Eastman AQ-29, осуществляют эффективный перенос электронов от восстановленного редокс-центра иммобилизованной МАО на стеклоуглеродный электрод. Изучена зависимость тока окисления этих соединений от концентрации субстрата БА и показано, что в биоэлект-рокаталитическом процессе ферментативная реакция является лимитирующей стадией. Этот вывод позволяет использовать зависимость анодного тока от концентрации моноамина в качестве калибровочного графика при анализе биогенных аминов.
Ключевые слова: моноаминоксидаза, медиатор, биоэлектрокатализ, искусственный акцептор электронов, анализ, моноамин, фенотиазины.
1. ВВЕДЕНИЕ
Основной задачей для создания эффективных амперометрических биосенсоров для определения биогенных моноаминов на основе моноаминоксидазы (МАО) является осуществление эффективного сопряжения электрохимического и биокаталитического процессов и подбор системы усиления сигнала, так как МАО является ферментом с низкой удельной активностью. Для этого необходимо подобрать такую биоэлектро-каталитическую систему, которая позволила бы обеспечить эффективность биоэлектрокаталитического окисления моноамина иммобилизованной моноаминоксидазой, как минимум близкую к эффективности гомогенной ферментативной реакции.
Флавинадениндинуклеатид (ФАД)-содержащие ферменты класса монаминокидаз играют определяющую роль в дезактивации биогенных моноаминов в организме теплокровных [1]. Установлена способность МАО катализировать также окисление производных тетрагидропиридина, что обусловливает триггерную функцию МАО,
1 Адрес автора для переписки: yaropolov@inbi.ras.ru (А.И. Ярополов).
прежде всего изофермента МАО-Б, в развитии некоторых нейродегенеративных процессов [2, 3]. В ходе каталитической реакции окислительного дезаминирования происходит взаимодействие активного центра фермента с амином и восстановление ФАД до ФАДН2 [4, 5]. Последующее реокис-ление ФАДН2 происходит при взаимодействии активного центра с дикислородом. С целью изучения функционирования акцептор-связывающе-го участка в активном центре фермента нами было предложено использовать в качестве искусственных акцепторов электронов принципиально новую группу соединений, способных заменять кислород в реакциях окисления аминов с участием МАО [6]. Использование искусственных акцепторов электронов (ИАЭ) в качестве переносчиков электронов в системе фермент-электрод позволит также получить новые данные о возможных путях и механизмах сопряжения электрохимического и биокаталитического процессов для моноаминоксидаз. Эти данные могут быть положены в основу разработки новых типов биферментных амперометрических биосенсоров с усилением сигнала для количественного определения биологически активных моноаминов. Предложенные ранее методы определения моноаминов на основе электрохимической детекции
пероксида водорода или иона аммония, образующихся при ферментативной реакции [7-9], не дают возможности увеличивать чувствительность измерения, так как отсутствует система усиления сигнала. Замена кислорода искусственными акцепторами электронов открывает новые подходы в решении этой проблемы - использование би-ферментных систем с целью повышения чувствительности.
Ранее нами было установлено, что МАО-Б способна эффективно окислять в анаэробных условиях модельные биогенные амины на электроде, модифицированном производными хинона [6]. В настоящей работе приведены данные по субстратной специфичности новой группы ИАЭ, фенотиазиновых и феноксазиновых красителей, в реакциях с МАО-Б. Исследованы кинетические закономерности и механизм взаимодействия МАО с ИАЭ в гомогенной ферментативной реакции и в гетерогенной биоэлектрокаталитичес-кой реакции на электродах из углеродистых материалов. Проведен сравнительный анализ эффективности биокатализатора в этих двух системах.
2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА 2.1. Материалы
Моноаминооксидаза-Б (молекулярная масса 80 кД) была выделена из печени быка по описанному ранее методу [10] и имела удельную активность 0.8-1.2 оп.ед./мин мг белка в реакции окисления бензиламина кислородом воздуха. В работе использовали следующие соединения в качестве ИАЭ: феназинметасульфат (ФМС) - производства фирмы "Aldrich", метиленовый голубой (МГ); толуидиновый синий (ТС); бриллиантовый крези-ловый синий (БКС) - производства фирмы "Sigma". Бензиламин (БА), фирмы "Sigma", был дополнительно очищен перекристаллизацией. Для иммобилизации фермента и ИАЭ использовали анионный полиэлектролит Eastman AQ 29 (28% суспензия в воде) фирмы "Kodak" и глутаровый альдегид фирмы "Serva". В качестве материала электрода использовали стеклоуглеродные стержни диаметром 4 мм (рабочая поверхность - торец стержня, S = 0.13 см2) и сажу ПМ-100 с удельной поверхностью 98 м2/г. Для модификации поверхности электрода из сажи и одновременно в качестве связующего использовали полиэтиленимин фирмы "Sigma", последовательно алкилированный цетил-и этилбромидом (ЦЭПЭИ), как описано в [11]. Для приготовления буферных растворов использовали препараты KH2PO4, KOH производства "Реахим" квалификации "х.ч." и дважды перегнанную воду.
2.2 Кинетические измерения
Кинетические исследования субстратных свойств ИАЭ проводили спектрофотометричес-ким методом (по изменению оптической плотности субстрата-красителя) в анаэробных условиях: в среде газообразного водорода, полученного электролитически и освобожденного от следов кислорода при прохождении через палладирован-ный асбест при 350°С.
2.3. Иммобилизация МАО на поверхности электрода
Совместную иммобилизацию МАО и катионов исследуемых красителей на стеклоуглерод-ном (СУ) электроде осуществляли путем включения их в матрицу отрицательно заряженного ио-нобменного полимера Eastman AQ-29 (полиэфира серной кислоты). На торцевую полированную поверхность СУ-электрода, предварительно очищенную путем последовательной обработки суспензией Al2O3 в воде, ультразвуком и ацетоном, наносили 10 мкл 1% суспензии полимера в буфере (pH 7.4), содержащем 0.3 нмоля фермента и 14 нмолей ИАЭ.
Изготовление электродов из сажи, модифицированных ЦЭПЭИ, и иммобилизацию на них фермента осуществляли по нижеописанной методике. Суспензию сажи в бензоле (60 мг/мл), содержащем полимер (10%), наносили на золотую проволоку (S = 0.35 см2) и высушивали при 20°С. Полная поверхность нанесенной на электрод сажи составила 2000 (±500) см2. Активирование поверхностных групп проводили в течение 15 часов при 37°С, используя 7.5%-ный раствор глутарового альдегида. После этого электрод помещали в раствор фермента в фосфатном буфере (0.7 мг/мл, pH 7.4) и инкубировали его в этом растворе при 4°С в течение 18 ч. Электроды с иммобилизованным ферментом отмывали от несвязавшегося белка рабочим буферным раствором (pH 7.4). Электроды хранили в том же растворе при 4°С. Перед экспериментом модифицированные электроды подвергали электрохимической обработке, которая заключалась в циклическом сканировании потенциала от -0.4 В до 0.3 В (относительно Ag/AgCl) в буферном растворе до получения воспроизводимой вольт-амперной кривой.
2.4. Электрохимические измерения
Количество восстановленного в ферментативном процессе ИАЭ определяли вольтамперометри-чески или по пиковому значению тока, возникающему при подключении электрода к цепи поляро-графа с установленным потенциалом (-30 мВ для МГ) и названному нами "бросковым" током [12].
После добавления в электрохимическую ячейку, содержащую буферный раствор (рН 7.4), субстрата-донора электронов (бензиламина) и перемешивания раствора модифицированный электрод выдерживали при разомкнутой цепи 5-60 с. В течение этого времени протекала ферментативная реакция, в результате которой в приэлектрод-ном слое накапливалась восстановленная форма ИАЭ. Количество восстановленного ИАЭ определяли по увеличению анодного тока по сравнению с током в фоновом растворе. Для получения воспроизводимых результатов циклические вольт-амперные кривые в рабочем растворе фиксировали после предварительной стабилизации модифицированного электрода в фоновом растворе.
Циклическую анодно-катодную вольт-амперную кривую на СУ-электроде записывали, используя осциллографический полярограф ЦЛА-03. Анодную вольт-амперную кривую на электроде из сажи и "бросковый" ток регистрировали с помощью полярографа ППТ-1. Модифицированный электрод использовали в качестве рабочего, насыщенный каломельный и хлоридсеребря-ный соответственно как вспомогательный и электрод сравнения. Электрохимические исследования свойств ИАЭ проводили в газовой среде водорода.
2.5. Оценка доли поверхности электрода
из сажи, заполненной иммобилизованным ферментом
Основываясь на выводах работы [13], можно предположить, что не вся поверхность пор сажи смачивается электролитом в процессе иммобилизации МАО. Для достаточно приблизительной оценки доли поверхности электрода, занятой белком, использовали экспериментальные результаты, полученные в работе [12]. В этой работе использовали лакказу как ферментативную метку в электроиммуноанализе. Лакказа в присутствии кислорода осуществляет прямой безмедиаторный перенос электрона с активного центра на поверхность электрода из углеродистых ма
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.