научная статья по теме ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ»

УДК 576.12

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТРОМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

© 2013 г. Е. Р. Андреева, И. В. Андрианова, П. И. Бобылева, А. Н. Горностаева, Л. Б. Буравкова

ФГБУНГНЦРФ — Институт медико-биологических проблем РАН, Москва Поступила в редакцию 29.03.2013 г.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) человека сокультивировали 72 часа с аллогенными мононуклеарами (МНК) крови, отличающимися по зрелости входящих в них клеток (лимфоциты из периферической и пуповинной крови) и по функциональному статусу (интактные и фитогемагглютинин (ФГА) — активированные лимфоциты периферической крови). Содержание популяций (Т-, 5-клеток, естественных киллеров — ЕК) и субпопуляций Т-клеток в исходных МНК и пкМНК находилось в пределах физиологических референсных значений для лимфоцитов периферической крови взрослого человека. После сокультивирования с ММСК снизилась доля 5-клеток среди МНК и пкМНК, а доля Т- и ЕК уменьшилась только среди пкМНК (р < 0.05). Среди Т-клеток для МНК и пкМНК было показано снижение Т-ЕК. В сокультуре ММСК с ФГА-МНК обнаружено уменьшение С08+клеток (р < 0.05), снижение доли НЬА-ВВ+ и увеличение СШ5+лимфоцитов по сравнению с монокультурой ФГА-МНК.

Результаты проведенного исследования показывают, что взаимодействие с ММСК не приводит к серьезным сдвигам в популяционном составе аллогенных лимфоцитов вне зависимости как от зрелости клеточных элементов (МНК га пкМНК), так и активации (МНК МНК-ФГА), и показатели остаются в физиологически допустимых границах. Кроме того, в присутствии ММСК доля живых лимфоцитов не уменьшается, а в случае клеток разной степени коммитированности (пкМНК) ММСК способствуют подержанию их жизнеспособности.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), мононуклеары периферической крови (МНК), мононуклеары пуповинной крови (пкМНК), межклеточные взаимодействия, иммуносупрессия

DOI: 10.7868/S0131164613050032

В последние десятилетия значительный прогресс достигнут в изучении вклада мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в поддержание физиологической целостности тканей и их ремоделирование [1]. Способность ММСК регулировать ответ иммунных клеток позволяет рассматривать их как весьма перспективный инструмент для клеточных технологий [2]. В частности, интерес может представлять иммуносупрессивный потенциал ММСК в отношении аллогенных иммунных клеток при использовании ММСК для клеточной терапии, а также в качестве фидера при экспансии гемопоэтических клеток ex vivo. При аллогенном введении возможно взаимодействие ММСК как с интактными, так и с активированными иммунными клетками, а в случае такого перспективного источника гемопоэ-тических предшественников как пуповинная кровь, ММСК будут контактировать с иммунными клетками различной степени зрелости. В обоих

случаях речь идет о взаимодействии ММСК с гетерогенной популяцией лейкоцитов.

Хорошо известно, что различные популяции иммунных клеток тесно взаимодействуют между собой, обеспечивая скоординированный ответ, определяемый, в том числе, и соотношением их популяций. К сожалению, вопрос о том, как ММСК влияют на субпопуляционный состав ин-тактных (неактивированных) лимфоцитов периферической и пуповинной крови, практически не изучен, тогда как такие данные могут внести существенный вклад в понимание физиологических процессов модуляции свойств гематогенных клеток при взаимодействии со стромальным компарт-ментом.

В настоящей работе исследовано влияние ММСК на популяционный состав, субпопуляции Т-клеток и жизнеспособность лейкоцитов пупо-винной крови и периферической крови взрослого человека.

Таблица 1. Жизнеспособность МНК периферической и пуповинной крови после 72 часов в монокультуре и в со-культуре с ММСК

Монокультура Сокультура с ММСК

МНК пкМНК МНК пкМНК

Живые клетки, % от исходных 96 ± 1 70 ± 8 94 ± 2 95 ± 3*

Примечания. Расшифровку аббревиатур здесь и в табл. 2 и 3 см. в тексте. Данные представлены как M ± m 5 независимых экспериментов. * Достоверное отличие от значений для монокультуры (р < 0.05).

МЕТОДИКА

ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека получали с помощью ферментативной обработки по методу Зак [3] в нашей модификации [4]. ММСК культивировали в среде a-MEM (MP Biomedicals, США), содержащей 1% антибиотик-антимикотик (пенициллин-стрептомицин-фунгизон) (Gibco, США) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hyclone, США), в экспериментах использовали ММСК 2-4-го пассажа.

Мононуклеары (МНК) выделяли из периферической крови здоровых добровольцев по стандартной методике на градиенте Ficoll-Histopaque (Sigma, США) с плотностью 1.077. Для активации МНК в среду добавляли фитогемагглютинин (ФГА) (Sigma, США) в конечной концентрации 10 мкг/мл.

Мононуклеарные клетки пуповинной крови (пкМНК) человека были получены из Банка стволовых клеток "КриоЦентр" (г. Москва).

МНК, активированные ФГА (МНК-ФГА), пкМНК в концентрации 106/мл в среде RPMI-1640 c 5% инактивированной ЭТС помещали в культуральные чашки с 70—80% монослоем ММСК и далее культивировали в течение 72 часов. Затем отбирали суспензию клеток и характеризовали популяционный состав МНК и пкМНК, а также их жизнеспособность.

Фенотипический анализ стромальных клеток проводили с применением флуорохромных конъ-югатов моноклональных антител к следующим поверхностным маркерам: CD45, CD90, CD105, CD73 (BD Biosciences, США).

Для характеристики популяционного состава лейкоцитов и субпопуляций Г-клеток использовали панель моноклональных антител "Иммуно-7" для проточного цитофлюориметра Epics XL (Beckman Coulter, США), оценивая долю CD3+(Г-клетки), CD3-/CD19+ (В-клетки), CD3-/ CD16+/CD56+ (естественные киллеры — ЕК-клетки), CD3+/CD4+ (Г-хелперы),

CD3+/CD8+ (Г-супрессоры), CD3+/CD16+/CD56+ (Г-ЕК-клетки), CD3 +/HLA-DR+, CD3+/CD25+ (антитела были помечены флюорохромами FITC или PE производства Beckman Coulter или BD Biosciences).

Жизнеспособность клеток оценивали цито-флюориметрически с помощью набора Annexin-V-FITC/PI (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя.

Анализ флюоресценции клеток проводили на проточном цитофлюориметре Epics XL, используя программное обеспечение System II для захвата и анализа изображения (Beckman Coulter).

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ "Statistica 7.0", используя ¿-критерий Стьюдента или непараметрический критерий Манна—Уитни. Различия считались достоверными приp < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В монокультуре и в сокультуре с ММСК МНК периферической крови сохраняли такую же высокую жизнеспособность после 72 часов, как МНК сразу после выделения (табл. 1). Напротив, доля живых пкМНК после 72 часов в монокультуре была достоверно ниже, чем среди сокультивирован-ных с ММСК (табл. 1).

Соотношение популяций лимфоцитов и субпопуляций Г-клеток в исходных МНК и пкМНК приведено в табл. 2. Показатели для МНК периферической крови находились в пределах физиологических референсных значений для взрослого человека (протокол "Иммуно-7", Beckman Coulter). Несмотря на то, что состав пуповинной крови достаточно динамичен и формальные физиологические границы показателей для популяций лимфоцитов не установлены, полученные в нашей работе результаты по пкМНК находились в тех же пределах, что и МНК. Тем не менее, надо отметить, что по некоторым показателям отличия между МНК и пкМНК были обнаружены. Так, доля В- и ЕК-кле-ток была выше среди пкМНК, а Г-ЕК, напротив — среди МНК. Процент спонтанно активированных Г-клеток, несущих рецептор к интерлейкину (ИЛ)-2 (CD25+клетки), был невелик, при этом среди пкМНК доля этих клеток была примерно в 2 раза больше, чем среди МНК. По антигену главного комплекса гистосовместимости класса II — HLA-DR, была выявлена обратная ситуация: пкМНК практически не имели этого антигена, а среди

Таблица 2. Иммуноцитохимическая характеристика исходных популяций МНК и пкМНК

Относительное содержание основных клеточных популяций, %

МНК пкМНК значения, %

СП3+/Ст9— (Т) 81.7 ± 2.1 77.0 ± 4.3 55—88

СБ3~/СБ19+ (В) 6.4 ± 0.8 11.1 ± 3.2 5—19

С£37СШ6+/С£56+ (ЕК) 7.3 ± 1.0 9.7 ± 2.1 6—20

СБ3+/СБ4+ (Г-хелперы) 50.2 ± 3.1 59.3 ± 4.7 31—51

СБ3+/СБ8+ (Г-супрессоры) 27.6 ± 1.9 22.9 ± 1.8 12—30

СБ3+/СБ16+/СБ56+ (Т-ЕК) 7.2 ± 1.7 1.6 ± 0.6 0—5

СБ3+/НЬА-БК+ 3.6 ± 0.7 0.2 ± 0.0 5—20

СБ3+/СБ25+ 2.2 ± 0.4 5.1 ± 0.7

Физиологические референсные

МНК некоторое количество их обнаруживалось (табл. 1).

Сокультивирование с ММСК в течение 72 часов привело к изменениям в популяционном составе лимфоцитов, активации Г-клеток и соотношении их субпопуляций как среди МНК, так и пкМНК (рисунок, А-В).

Доля Г-клеток незначительно, но достоверно увеличилась только среди пкМНК. Процент В-клеток в МНК несколько снизился, а среди пкМНК значительно уменьшился (р < 0.05). В случае ЕК-клеток для МНК изменений практически не выявлено, а среди пкМНК доля ЕК снизилась более чем в 2 раза (р < 0.05) (рисунок, А).

Для субпополяций Г-клеток существенные изменения как для МНК, так и пкМНК были выявлены только среди Г-ЕК. Доля этих клеток уменьшилась, причем в случае с пкМНК — достоверно (р < 0.05) (рисунок, Б).

Интересны результаты по представленности спонтанно активированных Г-клеток после взаимодействия с ММСК. Как уже говорилось выше,

спонтанная активация Г-клеток была весьма незначительна. Тем не менее, НЬА-БК+ клеток среди МНК стало несколько меньше, в пкМНК они практически отсутствовали (рисунок, В). Доля Г-клеток с ранним маркером активации СБ25 среди МНК увеличилась (р < 0.05), а среди пкМНК — уменьшилась.

После 72 часов в монокультуре среди МНК-ФГА периферической крови не было выявлено изменений в популяционном составе лимфоцитов и субпопуляционном составе Г-клеток (табл. 3) по сравнению с исходными МНК (табл. 2), а доля активированных СБ3+/НЬА-БК+ и СБ3+/СБ25+ лимфоцитов значительно увеличилась. Сокультивирование с ММСК привело к достоверному уменьшению С08+клеток. Кроме того, достоверно снизилась доля лимфоцитов, экспрессирующих антиген главного комплекса гистосовместимости класса II — НЬА-БЯ, а

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком