БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, М 3, с. 218 ■ 225
УДК 577.152321*6,02
ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ ЛАМИНАРАНОВ В I -3;1 -б-Р-Я-ГЛЮКАНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ
© 1995 г. Т. Н. Звягинцева*, Л. А, Елякона, В. В, Исаков
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022, Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, 159 Поступила в редакцию 21.10,93 г. После доработки 20.06,94 г.
Из продуктов трансформации ламинарана из Ьапг.папа скИогю1йе8 под действием эндо-1—З-р-Д-глю-каназы Л0 из СМату$ а1Ыёиз был выделен новый 1—3;1—6-Р-О-глюкан - иммуностимулятор, названный траисламом, структура которого отлична от структуры исходного ламинарана. Он имеет более высокую молекулярную массу, содержит в 2.5 раза большее количество I -»-6-связанных остатков глюкозы, сосредоточенных преимущественно на невосстанявливаюхцем конце молекулы. Помимо разветвлений 1—<-6-связанные остатки £>-глюкозы включены также в основную цепь 1—^З-р-О-глюкана. Образование транслама можно объяснить обнаруженной у эндо-1—*-3-р-£>-глюка-назы Л0 способностью катализировать в процессе трансгликозилирования синтез не только р-1—»-3-, но и Р-1-"6-глюкозидных связей.
Ключевые слова: 1—3;1—•■б-р-И-глюканы, и.ммуноспшмуляторы, ферментативный синтез, трансгликозилирование, ламипараны, эндо-1 ^-З-р-Э-глюканазы.
Актуальность изучения р-/)-глюканаз, а также 1—З-^-Л-глюканои (субстратов Р-£>-глюка-наз) связана с непосредственным участием этих веществ в системах иммунитета как животных, так и растений [1 - 7]. Так, клеточные стенки грибов, в том числе и патогенных, содержат 1— 3;1—- 6-р-£>-глюканы. При контакте гриба с живым организмом происходит разрушение клеточных стенок гриба и освобождение фрагментов, содержащих 1— 3; 1-*6-Р-£>-глюкоолиго- и полисахариды, которые служат сигнальными молекулами, оповещающими организм хозяина о внедрении патогена. В ответ на этот сигнал происходит развитие иммунных реакций в живых организмах [1 - 5]. В качестве примера использования положительных свойств Р-Д-глю-канов можно привести шизофиллан и лентинан -грибные 3;1—6-Р-/)-глюканы, а также 1->-3; 1—6-р-О-глюкан из пивных дрожжей, которые применяются в клиниках Японии и США как иммуностимуляторы [4, 5].
Биологическая активность р-О-глюканов, очевидно, связана с особенностями их первичной и пространственной структур. Анализ литературных данных показывает, что для —6-Р-О-глкжа-нов, обладающих противоопухолевой активностью, характерны относительно высокая молекулярная масса (А/ >16 кДа) [2] и некоторое ко-
* Автор дли переписки.
личество 1-*-б-связанных остатков /З-глюкозы, содержащихся в виде ответвлений от основной цепи [1,4, 5]. Часто эти полисахариды (например, лентинан и шизофиллан) имеют регулярную структуру. Сосредоточение р-1^6-связанных остатков С*-глюкозы на невосстан ав л ив ающе м конце [6] или включение их в цепь 1-~3-Р-£>-глюкана [7] также не препятствует проявлению противоопухолевой активности. Обязательно наличие пространственной структуры в виде одиночной или тройной спирали [8].
Ранее было показано, что эндо-1->-3-р-/)-глю-каназы Л1У и Л0 из морских моллюсков Spi.sU/a и С Мату5 а1ЬШц$ отличаются повышенной в сравнении с другими карбогидразами способностью к реакциям трансгликозилирования [9 - 11] Так как результатом реакции трансгликозилирования является удлинение углеводной цепи акцептора, при действии эндоглюканаз на ламинараны можно ожидать образования более высокомолекулярных веществ, чем исходные. Цель данной работы - применение ферментов с изученным механизмом действия для направленного преобразования неактивных ла-минаранов в более высокомолекулярные биологически активные р-£>-глюканы.
Факты образования хитиноподобного полисахарида при действии лизоцима на хитоолигосаха-риды, а также высокомолекулярного р-О-глюка-на в результате действия трансгликозилазы на
целлопентаозу описаны в литературе [12, 13], Нужно отметить, что синтезированные этими кар богидраза ми полисахариды нерастворимы в воде; таким образом, их образование можно наблюдать визуально и выделить их из смеси продуктов нетрудно.
В качестве акцепторов в реакциях трансглико-зилирования, естественно, могут выступать продукты, образующиеся в процессе гидролиза лами-нарана (глюкоза и г лго к о ол игоса х ар ид ы), а также исходный ламинаран. Следовательно, при гидролизе ламинарана эндоглюканазами также можно было ожидать появления (З-О-глюканов с молекулярной массой большей, чем у исходного субстрата. Чтобы найти такие высокомолекулярные вещества в продуктах действия эндо-1 -»-З-р-Д-глю-каназ Л1У из 5. хасИаИпепх^ и ЛО из С. а1Ь1с1ш на ламинаран из Ьапипапа (ж1гопок1е$, было изучено молекулярно-весовое распределение этих продуктов с помощью гель-фильтрации на сефадексе С-50. В результате в продуктах трансформации лнминарапа под действием ЛО в условиях высокой концентрации субстрата была обнаружена и выделена фракция [3-£>-глгоканов, более высокомолекулярных, чем исходный ламинаран, названных трансламом. Исследование биологической активности транслама показало, что он обладает иммуномодулирующими свойствами в отличие от исходного ламинарана [14]. Выход транслама в оптимальных условиях составляет 20 - 25% от исходного ламинарана (табл. 1).
Ламинаран из бурой водоросли Ь. < иЧюг101<1е$ (М„ = 5 кДа) является смешанным 1 —>-3;I——6-р-О-глюканом, содержащим около 10% Р-1-»6-связан-ных остатков ¿>-глюкозы в виде единичных ответвлений от основной цепи 1~^3-[3-£)-глюкана. Восстанавливающие концы молекул ламинарана приблизительно на 60 - 80% блокированы манни-том [15]. Структуру и механизм образования нового 1—3;1-«-6-[3-/)-глюкана, полученного фермен-
Номер фракции
Рис. 1, Гель-фильтрация на сефадексе G-S0 ламинарана из L. cichorioidex (I), транслама (2) и продуктов деградации по Смиту ламинарана (J) и транслама (4); I - выход декстранои с Mw 40 (!), 20 (II), К) кДа (III) и инулина с Mw 5 кДа (IV).
тативиой трансформацией ламинарана, устанавливали, анализируя данные гель-фильтрации, 13С-ЯМР-спектроскопии, метилирования, деградации по Смиту и действия на него экзо-1-^3-ß-D-глюканазы ЛИ из Eulota maakii [16].
Молекулярная масса транслама, определенная гель-фильтрацией (Mw), составила приблизительно 8 кДа (п 50) против 5 у исходного ламинарана (рис. 1); определенная концевым анализом степень его полимеризации (п ~ 50) и молекулярная масса (Мп) хорошо соответствуют Mw (табл. 1). В молекуле транслама отсутствует маннит (рис. 2,
Таблица 1. Молекулярно-весовое распределение продуктов ферментативной трансформации различных лами-наранов на сефадексе С-50 (% от исходного субстрата) и характеристика фракций*
Интервал Mw L. cichorioid.es (Ми 5 кДа) L. gurjanovae {Mw 4.5 кДа) F. evanescens (Mw 5 хДа)
(кДа) фракций выход, % 1.3 : 1.6 п выход "М 1.3 : 1.6 п выход. °/о 1.3 : 1.6 п
<2 20 90 : 10 н, о. 30 95:5 н. о.** 10 н. о. 4
2-4 5 85 : 15 н. о. 10 95 : 5 н, о. 30 70 : 30 16
4-6 30 80:20 н. о. 40 90 : 10 н. о. 60 60:40 32
6-8 25 80:20 н. о. 10 80 : 20 н. о. - -
8- 12 20 75 : 25 50 - 70 10 75 : 25 50 - 70 - - -
* Соотношение I и ! -глюкозидных связей определяли из !3С-ЯМР-сгтектров, степень полимеризации фракций
(п) - концевым анализом (из соотношения количеств общих и восстанавливающих Сахаров, полученных методами фсиол-сернокислотным и Нельсона соответственно).
** Не определяли (н. о'.).
*** Фракция отсутствует.
60 м. д.
Рис, 2, 13С-ЯМР-спектры транслама (а) и ламинарана (б).
табл. 2). Содержание р-1—6-связей в новом глю-кане равно 25%, тогда как в ламинаране - 10%. Это следует из анализа 13С-ЯМ1'-спектров и данных метилирования (рис. 2, табл. 2, 3).
Соотношение количества р-1—3- и (3-1—6-связанных остатков глюкозы определяли из значений интегральных интенеивностей сигналов схим, сдвигами 61,9 и 69.9, 70.8 и 68.9 или 103 и 85 - 86 м. д. [17]. Присутствие в молекулах транслама различных типов [3-1—6-связанных остатков £>-глнжозы следует из наличия в его 13С-ЯМР-спектрах двух сигналов примерно одинаковой интенсивности (75,7 и 76.0 м. д.), принадлежащих С5-атомам [3-1— 6-связанных остатков О-глюкозы [17] (рис. 2, табл. 2). В спектрах 13С-ЯМР ламинарана имеется практически лишь один сигнал (3-1—6-связанного остатка Д-глкжо-зы с химическим сдвигом 75.7 м. д. Этот сигнал,
по всей видимости, принадлежит 3,6-связанным остаткам О-глюкозы (точка ветвления), тогда как сигнал с химическим сдвигом 76.0 м. д. -(3-1— 6-связанным, включенным в цепь остаткам глюкозы (рис. 2).
Присутствие и количество 1,3,6- и р-1—6-связанных остатков О-глюкозы в молекуле транслама было определено также с помощью метилирования (табл. 3) и составило 12 и 8%, что хорошо соответствует данным 13С-ЯМР-спектроскопии.
Деградация по Смиту синтезированного р-О-глюкана в условиях [15] приводит к распаду его молекул на более мелкие фрагменты (рис, 1). Такая фрагментация может происходить, если в цепь 1— 3-Р-£>-глюкана включены Р-1—6-связи. Аналогичная обработка ламинарана не вызывает фрагментации его молекул; происходит лишь снятие 1—6-разветвлений без заметного изменения
молекулярной массы. Таким образом, в молекуле транслама помимо 1,3-, 1,3,6-связанных остатков О-глюкозы присутствуют Р-1—6-связанные внутрицепочечные остатки глюкозы в количестве, сопоставимом с 1,3,6-связанными (рис. 1, 2, табл. 2, 3).
Распределение фрагментов, содержащих 1—6-связанные остатки глюкозы в трансламе, было изучено с помощью экзо-1—3-Р-£>-глю-каназы ЛИ из Е. таакИ [16]. Специфичность этого фермента такова, что он, начиная гидролиз Р-1 —3-связей с невосстанавливающего конца молекулы субстрата, обходит 1—6-связанные остатки глюкозы, образуя в качестве продуктов реакции глюкозу и из разветвлений днсахарид - генциобиозу. Отношение количества генциобиозы к глюкозе в процессе гидролиза 1—3;1—6-р-О-глюканов экзоферментом должно отражать распределение 1 —6-связей по
цепи глюкана. Если это отношение постоянно, распределение 1—6-разветвлений по цепи должно быть равномерным; если оно уменьшается в процессе реакции, основная часть разветвлений сосредоточена на невосстанавливающем конце молекулы; если увеличивается - на восстан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.