ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 2, с. 169-174
УДК 577.152.192.3
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ЭЛЕКТРОПРОВОДЯЩИХ БИОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ ДНК И ОПТИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПОЛИАНИЛИНА
© 2012 г. Ю. С. Зейфман*, И. О. Майборода*, Ю. В. Грищенко*, О. В. Морозова**, И. С. Васильева**, Г. П. Шумакович**, А. И. Ярополов**
*НИЦ "Курчатовский институт", Москва, 123182 **Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва,119071 e-mail: yaropolov@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 26.08.2011 г.
Методом окислительной полимеризации анилина с использованием двух различных биокатализаторов: пероксидазы из корней хрена и биомиметика — микропероксидазы-11 синтезированы электропроводящие интерполимерные комплексы полианилина на матрице ДНК. Исследованы спектральные характеристики и морфология полученных биокомпозитов. Показано различие стерео-специфичности получаемых образцов интерполимерных комплексов в зависимости от используемого биокатализатора. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли биокатализатора в формировании направления закручивания спирали электропроводящего полимера на матрице ДНК, т.е. оптическая активность получаемых образцов полимеров, по-видимому, связана со свойствами биокатализатора.
Молекулы ДНК являются уникальными строительными блоками для создания биосовместимых наноматериалов и молекулярных электрических схем благодаря их самоорганизации, а также возможности получать различные наноструктуры высокой сложности. В последние годы было получено большое количество подобных наноструктур из молекул ДНК, например различные двумерные ансамбли [1, 2], геометрические объекты (кубы [3], октаэдры [4]) и др. Исследования также показали отсутствие существенной собственной проводимости ДНК [5, 6], что обусловливает необходимость разработки композитов на основе нуклеиновых кислот и электропроводящих материалов для создания электронных структур на их основе. Ранее была показана возможность использования ДНК в качестве матрицы для синтеза металлических нанопроводов [7], полупроводниковых наночастиц [8] и электропроводящих полимеров [9—11]. В частности, использование электропроводящих полимеров при конъюгации с ДНК может стать основой для разработки биокомпозитных материалов и создания молекулярных устройств, контролирующих влияние внешних факторов на биологические системы, например высвобождение лекарственных препаратов, конструирование нервных имплан-татов и искусственных мышц [12], а также имплантируемых источников электропитания (суперконденсаторов) [13].
Полианилин (ПАНИ) является одним из наиболее важных электропроводящих полимеров в
силу своей высокой химической стабильности, простоты получения, относительно высокой электропроводности и способности изменять физико-химические свойства при различных физических воздействиях (рН, электрическое напряжение). Классический химический метод синтеза электропроводящего ПАНИ, в котором окислителем реакции полимеризации мономера выступает персульфат аммония, требует эквимолярно-го количества окислителя и проведения реакции в сильно кислых средах при температуре, близкой к 0°С [14]. Использование ферментов при синтезе ПАНИ позволяет проводить процесс в экологически чистых и мягких условиях и получать полимер, не загрязненный продуктами разложения окислителя. В работах [9, 15, 16] была продемонстрирована возможность использования лакказы (КФ 1.10.3.2) и пероксидазы из корней хрена (ПХ, КФ 1.11.1.7) для синтеза электропроводящего ПАНИ. Кроме того, было показано, что в зависимости от используемых ферментов может быть получен электропроводящий полимер с различной оптической активностью [17, 18]. Однако при использовании ПХ в качестве биокатализатора полимеризации анилина и различных оптических изомеров сульфокамфорной кислоты в качестве допантов, оптическая активность ферментативно синтезированного ПАНИ была одинаковой [17]. При использовании другого фермента — грибной лакказы, катализирующего, как и ПХ, реакцию ферментативной полимеризации анилина, оптическая активность синтезированного ПАНИ раз-
п.н. 1 2 3
1500
850
400
200
50
Рис. 1. Результаты электрофореза препарата ДНК в 1%-ном геле агарозы. 1 — маркеры, 2 и 3 — ДНК в количестве 150 нг и 1.5 мкг соответственно.
личалась в зависимости от хиральности используемой сульфокамфорной кислоты [18]. Следует отметить, что ввиду отсутствия асимметричных атомов в основной цепи ПАНИ его оптическая активность обусловлена спиралевидной конфор-мацией полимера, которая достигается путем использования в синтезе хиральных допантов.
Цель работы — подбор условий и проведение синтеза электропроводящего ПАНИ на матрице короткоцепочечной ДНК с использованием в качестве катализаторов реакции окислительной полимеризации анилина двух биокатализаторов: пероксидазы из корней хрена и ранее не используемого для синтеза электропроводящих полимеров биомиметика — микропероксидазы-11, а также исследование физико-химических характеристик полученных интерполимерных комплексов.
МЕТОДИКА
Ферментативный синтез интерполимерного комплекса ПАНИ/ДНК проводили при 25°С с использованием ПХ и при 4°С с использованием микропероксидазы-11 (МП). Раствор ДНК с концентрацией 0.5 мг/мл в 10 мМ Ма-цитратном буфере с рН 4.3, содержащий 1.55 мМ анилина (соотношение фосфатных групп ДНК и анилина равно 1 : 1), инкубировали при перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре для установления электростатического равновесия между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и протонированными аминогруппами молекул анилина. После инкубации в реакционную среду добавляли соответствующий фермент с конечными концентрациями в реакционной смеси 85 мкг/мл для ПХ и 110 мкг/мл для МП соответственно. Удельные активности используемых биокатализаторов, измеренные по окислению АБТС в 0.1 М Ма-цитратном буфере, рН 4.5, составляли 8.3 и 0.1 мкмоль/с • мг для ПХ и МП соответственно. Реакцию полимеризации мономера инициировали добавлением пероксида во-
дорода. Последний добавляли 4 порциями в течение 30 мин до конечной концентрации 1.55 мМ. Исходную концентрацию раствора пероксида водорода определяли перед проведением эксперимента по поглощению при длине волны 230 нм (молярный коэффициент экстинкции 72.7 М-1 см-1). Реакцию полимеризации анилина на матрице ДНК проводили в течение 4 ч при использовании ПХ и 24 ч при использовании МП. Для удаления непрореагировавшего мономера полученные биокомпозиты диализовали против 2000-кратного избытка деионизованной воды, подкисленной соляной кислотой до pH 4.3, в течение 16 ч при 4°С. До проведения измерений полученные образцы хранили при 4°С.
Дедопированные образцы ПАНИ/ДНК получали добавлением ~1 мкл 0.1 М раствора NaOH к 100 мкл образца биокомпозита. Редопирование проводили добавлением ~1 мкл 1 М раствора соляной кислоты.
Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Evolution 60 "Thermo Scientific" (США).
Измерения спектров кругового дихроизма (КД) проводила на КД-спектрометре Chirascan "Applied Photophysics" (Англия).
FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy) — исследование биокомпозитов проводили по стандартной методике с использованием таблеток KBr на спектрофотометре IRPrestige-21 "Shimad-zu" (Япония).
Морфологию синтезированных комплексов ПАНИ/ДНК изучали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) с использованием микроскопа NTEGRA "NT-MDT" (Россия) в полуконтактном режиме.
В работе использовали следующие реактивы: ДНК("Деринат") — "Техномедсервис ЗАО ФП" (Россия); маркеры для ДНК-электрофореза 50— 1500 п.н. SM1108 "Fermentas" (Литва); лимонная кислота, пероксидаза из корней хрена — RZ 2.5—4.0, микропероксидаза-11 — "Sigma-Aldrich" (США); H2O2, NaOH, HCl — реактивы марки о.с.ч (Россия). Перед проведением синтеза ПАНИ анилин ("Химмед", Россия) очищали вакуумной дистилляцией. Все растворы готовили с использованием воды, очищенной на установке Milli-Q "Milli-pore" (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез электропроводящих биокомпозитов ПАНИ/ДНК. Для синтеза интерполимерного комплекса использовали коммерчески доступный препарат дезоксирибонуклеата натрия ("Дери-нат"), содержащий молекулы ДНК от 50 до 900 пар нуклеотидов (рис. 1). В результате проведения реакции полимеризации анилина на матрице ДНК
(а)
0 350
550
750
950
нм
В
1.6
0 350
(б)
— 11
/у{ 7 "Л ' - а 5\
• ч \ 1 \ /| и \ 3
/' V
2
X V_____ — V _________________
„ - - __ 1
550
750
950
нм
Рис. 2. Изменение электронных спектров комплекса ПАНИ/ДНК от времени синтеза: а — синтез с использованием ПХ (1 — 5, 2 — 15, 3 — 60, 4 — 240 мин), б — синтез с использованием МП (1 — 30 мин, 2 — 120 мин, 3 — 24 ч).
с использованием обоих биокатализаторов были получены водные дисперсии интерполимерных комплексов ПАНИ/ДНК зеленого цвета. УФ-ви-димые спектры, записанные для этих водных дисперсий, демонстрировали наличие пиков поглощения в областях 420—750 нм, соответствующих электропроводящему ПАНИ [9], в составе обоих биокомпозитов (рис. 2). В контрольном эксперименте при том же самом значении рН реакционной среды (рН 4.3) в отсутствии ДНК при полимеризации анилина происходило образование коричневого водонерастворимого осадка разветвленного полимера. Это свидетельствовало о влиянии матрицы ДНК на образование электропроводящего полимера. На рис. 2а представлено изменение спектров поглощения комплекса ПАНИ/ ДНК при различных временах синтеза с использованием ПХ (образец ПАНИ/ДНК/ПХ). Пик поглощения в области 750 нм, присутствовавший на ранних стадиях протекания реакции, и отсутствие максимума поглощения в области 420 нм свидетельствовали об образовании перниграни-лина, согласно [9]. В процессе протекания реакции поглощение при этой длине волны уменьшалось, в то время как пик поглощения при 420 нм увеличивался, что может указывать на протони-рование основной цепи ПАНИ и образование электропроводящего ПАНИ с более упорядоченной структурой. Увеличение времени синтеза также приводило к появлению широкой полосы поглощения в диапазоне длин волн 700—1100 нм, что может свидетельствовать об увеличении длины цепи п-сопряжения, т.е. длины
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.