БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2011, том 28, № 3, с. 191-198
УДК 576.591
ФИКСАЦИЯ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА В СТРУКТУРЕ КВАЗИНЕМАТИЧЕСКИХ СЛОЕВ, ОБРАЗОВАННЫХ МОЛЕКУЛАМИ ДНК
© 2011 г. С. Г. Скуридин1, В. А. Дубинская2, Э. В. Штыкова3, В. В. Волков3, В. М. Рудой4, О. В. Дементьева4, В. А. Кузьмин5, Е. С. Лисицына5, С. Т. Захидов6, И. А. Зеленина6, Ю. М. Евдокимов1
Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, ул. Вавилова, 32, Москва, 119991; электронная почта: lancet-bio@bk.ru 2Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ГНУВИЛАР РАСХН, ул. Красина, 2, Москва, 123056; электронная почта: va@diamsoft.ru 3Учреждение Российской академии наук Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Ленинский просп., 59, Москва, 119333; электронная почта: shtykova@ns.crys.ras.ru 4Учреждение Российской академии наук Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Ленинский просп., 31, Москва, 119991; электронная почта: dema_ol@mail.ru 5Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики РАН, ул. Косыгина, 4, Москва, 117997; электронная почта: vak@sky.chph.ras.ru 6Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Ленинские горы, 1, стр. 12, Москва, 119991; электронная почта: stz49@mail.ru Поступила в редакцию 16.11.2010 г.
Показано, что наночастицы золота внедряются между двухцепочечными молекулами ДНК, образующими квазинематические слои в частицах холестерической жидкокристаллической дисперсии. Процесс внедрения наночастиц золота сопровождается изменением упорядоченного расположения соседних молекул ДНК в слое и приводит к нарушению пространственной структуры частиц дисперсии, что может быть одной из причин генотоксического эффекта этих наночастиц.
Ключевые слова: двухцепочечная ДНК, наночастицы золота, жидкокристаллические дисперсии ДНК, круговой дихроизм, рентгенографический анализ, структура лиотропных жидких кристаллов (био)полимеров, токсичность наночастиц.
В работах [1, 2] получены данные, позволившие высказать предположение, согласно которому биологическое действие наночастиц золота (Au) на пространственно организованные структуры ДНК in vitro и in vivo сходно с действием молекул, обладающих мутагенной активностью. Одной из таких структур, моделирующей некоторые пространственные свойства хромосом простейших, являются, как известно [3], частицы холе-стерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК.
С целью дальнейшего выяснения возможных причин, определяющих генотоксический эффект наночастиц Au, в настоящей работе продолжено исследование их взаимодействия с частицами ХЖКД двухцепочечной ДНК с привлечением различных физико-химических методов, включая рентгенографический анализ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез коллоидного раствора, содержащего квазиметаллические частицы Au, был выполнен
в соответствии с методом, описанным в работе [4]. Согласно данным динамического светорассеяния и электронной микроскопии средний диаметр наночастиц Au в исходном препарате составлял ~2-3 нм, а их числовая концентрация ~7.2 х 1014 частиц/мл.
Использовали дополнительно очищенный от примесей [5] и деполимеризованный препарат ДНК из тимуса крупного рогатого скота (Sigma, США) с молекулярной массой ~(0.3—0.7) х 106 Да.
Концентрацию ДНК в водно-солевых растворах определяли спектрофотометрически, пользуясь известным значением молярного коэффициента поглощения (smax = 6600 М-1 см-1 [6]).
Препараты полиэтиленгликоля (ПЭГ; Serva, Германия; молекулярная масса 4000 Да) и циани-нового красителя SYBR Green I (SG; Sigma, США) использовали без дополнительной очистки.
Концентрацию SG в растворах определяли спектрофотометрически, пользуясь значением его молярного коэффициента поглощения
(s494 ~ 73000 М-1 см-1 [7]). Исходный раствор SG хранили при 4°С в светонепроницаемом контейнере.
Водно-солевые растворы ДНК, ПЭГ и NaCl готовили на 10-2 М Na+-фосфатном буфере (pH ~ 7.0), а затем фильтровали для удаления возможных механических загрязнений через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0.8 мкм.
Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра Cary 100 Scan (Varian, США); спектры флуоресценции — используя спектрофлуориметр Cary (Varian, США), а спектры КД — при помощи портативного дихрометра СКД-2 [8]. Спектры КД представляли в виде зависимости разности интенсивностей поглощения лево- и правополяризованного света (АЛ) от длины волны (к):
АЛ = (Al — Ли) х 10—6 ОЕ.
Холестерическую жидкокристаллическую (ХЖК) фазу ДНК в ПЭГ-содержащем водно-солевом растворе (образец 1) готовили в соответствии с методикой, описанной в работе [9], и использовали для рентгенографического анализа.
Фазы ДНК для рентгенографического анализа, содержащие разное число наночастиц Au, готовили следующим образом.
Раствор ПЭГ, содержащий ХЖКД ДНК (V = 300 мл), делили на две части (V = 150 мл); в каждую из них добавляли гидрозоль Au. В колбу № 1 добавляли 18.75 мл смеси из 3.75 мл гидрозоля Au и 15 мл 0.3 М раствора NaCl; в колбу № 2 — 18.75 мл гидрозоля Au с таким расчетом, чтобы в обеих системах концентрации ДНК и ПЭГ были одинаковыми. Таким способом были приготовлены два образца ХЖКД ДНК (образец 2 и образец 3), обработанной гидрозолями с разными концентрациями наночастиц Au.
Через 30 мин после добавления наночастиц Au регистрировали спектры КД образцов 2 и 3 в интервале длин волн 250—350 нм. Наблюдаемое уменьшение амплитуды аномальной полосы в спектрах КД этих образцов соответствовало данным, полученным ранее [1].
Затем растворы ПЭГ, содержащие частицы ХЖКД ДНК, обработанные наночастицами Au, центрифугировали (5000 об/мин, 40 мин, 4°С; центрифуга К-23, Германия). Полученные после низкоскоростного центрифугирования осадки (~1.5 мг), представляющие собой фазы ДНК с разной концентрацией наночастиц Au, исследовали при помощи метода рентгенографического анализа. Измерения проводили на лабораторном дифрактометре АМУР-К (разработка СКБ Института кристаллографии РАН, Москва), технические параметры которого подробно описаны в работе [10].
Использовали длину волны рентгеновского излучения (к), равную 0.1542 нм, с применением
геометрии Кратки [11] в области значений волнового вектора в интервале 0.12 < s < 10.0 нм-1 (s = 4п sin ОД; 20 — угол рассеяния). Экспериментальные данные были нормированы на интенсивность падающего пучка, после чего в них вводили поправку на коллимационные искажения в соответствии со стандартной процедурой [12].
Обработку экспериментальных данных проводили при помощи программы PRIMUS, а анализ характеристических Брегговских пиков на кривых малоуглового рассеяния — при помощи программы PEAK [13].
Размер кристаллитов (L) определяли из полуширины максимума интенсивности первого Брегговского пика, пользуясь соотношением:
L =
X
(1)
Р,cos °i'
а степень разупорядоченности ДМ определяли как
ДМ =
1 Mi
(2)
где = п/s1 — период структуры (межплоскостное расстояние); ps — полная ширина на полувысоте максимума интенсивности рассеяния (в радианах), наблюдаемого на угле рассеяния 20!, соответствующего волновому вектору s1; А — среднеквадратичное отклонение от расстояния между ближайшими регулярно упакованными структурными элементами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обработка частиц ХЖКД ДНК наночастицами Аи приводит к уменьшению характерной для частиц этой дисперсии оптической активности, проявляемой, в частности, в виде интенсивной (аномальной) отрицательной полосы в спектре КД (рис. 1). Следует отметить [3], что аномальная полоса в спектре КД не только отражает наличие спирально-закрученной (или холестерической) структуры соседних квазинематических слоев, образованных молекулами двухцепочечной ДНК в частицах жидкокристаллической дисперсии (ЖКД), но и служит критерием "качества" сформированного холестерика, — чем выше амплитуда полосы, тем более упорядоченным является расположение молекул ДНК. Было показано, что уменьшение амплитуды аномальной полосы в спектре КД зависит от нескольких параметров: размера наночастиц Аи, их концентрации и температуры раствора [1, 3]. В частности, если диаметр наночастиц Аи равен 2 нм, то амплитуда аномальной полосы в спектре КД уменьшается на 75%, а при использовании наночастиц Аи диаметром 15 нм — только на 20% [1]. При этом, чем выше концентрация наночастиц Аи в растворе, тем более заметно уменьшение амплитуды аномальной полосы в спектре КД частиц ХЖКД ДНК.
Рис. 1. Спектры КД ХЖКД ДНК, предварительно сформированной в водно-солевом растворе ПЭГ (1), а затем обработанной наночастицами Аи (2—5): 1 —
Снано-Аи = 0 (контроль); 2 — С^но-Аи ~ 0Л6 х 1°И частиц/мл; 3 — Снано-Аи ~ 0.32 х 1014 частиц/мл; 4 —
Снано-Аи ~ °.48 х 1014 частиЦ/мл; 5 — Снано-Аи ~ 0.80 х
х 1014 частиц/мл. Сднк = 8.89 мкг/мл, Спэг = = 151.11мг/мл, 0.3 М №С1 + 10-2 М №+-фосфатный буфер. АЛ = (А^ — Ак) х 10—6 ОЕ; Ь = 1 см.
Под действием наночастиц Аи амплитуда аномальной полосы в спектре КД ХЖКД ДНК уменьшается за весьма малый промежуток времени (~90 с). Такой оптический эффект может быть следствием двух причин. Во-первых, наночасти-цы Аи малого размера могут располагаться в бороздке ДНК, образуя комплекс с парами оснований (в частности, с атомами N7 пуринов [14, 15]). Такое взаимодействие с парами азотистых оснований может нарушать их ориентацию по отношению к оси двухцепочечных молекул ДНК, упакованных в квазинематических слоях структуры частиц ХЖКД. Во-вторых, наночастицы Аи, взаимодействуя с молекулами ДНК, могут нарушать характер взаимной ориентации соседних молекул ДНК как в одном квазинематическом слое, так и соседних слоях. Сочетание этих причин позволяет сказать, что действие наночастиц Аи приводит не только к уменьшению величины "параметра порядка" (6) молекул ДНК, упорядоченных в квазинематических слоях, до ~0.3 [16] (величина ^ в исходной структуре частиц ХЖКД близка к 0.8 [16]), но сопровождается и уменьшением (вплоть до полного исчезновения) спиральной закрутки квазинематических слоев в структуре частиц ХЖДД ДНК. Это означает, что наночастицы Аи индуцируют переход спирально-закрученной (холес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.