ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 5, с. 676-680
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 575.86:597.553.2
ФИЛОГЕНИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ (Salmoniformes: Salmonidae) И ЕЕ МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДАТИРОВКА: АНАЛИЗ ЯДЕРНОГО ГЕНА RAG1 © 2012 г. С. В. Шедько, И. Л. Мирошниченко, Г. А. Немкова
Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделенияРАН, Владивосток 690022 e-mail: shedko@biosoil.ru Поступила в редакцию 03.11.2011 г.
Исследованы филогенетические взаимоотношения 26 видов лососевых рыб (сем. Salmonidae) с использованием гена RAG1 в качестве филогенетического маркера. Взаимоотношения хариусов, сигов и лососей однозначно установить не удалось; дивергенция этих линий, по-видимому, произошла в сравнительно короткий («3—4 млн. лет) промежуток времени. Первой, вероятно, обособилась линия хариусовых рыб. Роды подсемейства Salmoninae слагают две хорошо выраженные монофилети-ческие группировки — (1) Brachymystax и Hucho, а также (2) Salmo, Parahucho, Salvelinus, Parasalmo и Oncorhynchus. Предковые формы этих двух эволюционных линий могли дивергировать на границе олигоцена и миоцена («24 млн. лет назад). Диверсификация основных линий внутри второй группировки происходила, по всей видимости, сравнительно быстро в среднем миоцене («19—16 млн. лет назад). При этом линии Salvelinus и Parasalmo вместе с Oncorhynchus разделились в последнюю очередь. Вероятно, в этот же период времени разошлись предковые линии родов Prosopium и Core-gonus.
Лососевые рыбы (сем. Salmonidae) — модельная группа для изучения ряда актуальных проблем эволюционной биологии, геномики и других разделов современной биологии [1, 2]. Очевидно, что наличие обоснованной филогенетической схемы является необходимым условием для корректного планирования сравнительных исследований и интерпретации их результатов. Несмотря на достигнутый в последнее время прогресс в понимании филогенетических связей внутри Salmonidae, некоторые принципиальные вопросы все еще остаются нерешенными. Во-первых, не ясен порядок дивергенции трех главных линий Salmonidae — хариусовых (подсем. Thymallinae), сиговых (Coregoninae) и лососевых (Salmoninae) рыб. Во-вторых, нет единого мнения относительно филогенетических взаимоотношений основных линий внутри Salmoninae — Hucho и Brachymystax; Parahucho; Salmo; Salvelinus; Parasalmo и Oncorhynchus.
Настоящее исследование направлено на решение указанных вопросов при использовании проверенного и хорошо себя зарекомендовавшего [3, 4] филогенетического маркера, нового для данной группы рыб — однокопийного ядерного гена RAG1 (гена, активирующего рекомбинацию 1). В результате получена вполне приемлемая схема филогении Salmonidae, а также, с некоторыми допущениями, проведена ее молекулярная датировка.
В работе использовали 62 образца ДНК, полученных стандартной фенольно-хлороформной экстракцией из мышечных тканей 23 видов лососевых рыб: Thymallus arcticus (р. Катунь, n = 1), Th. tugarinae (р. Киевка, n = 2), Coregonusmigratori-us (оз. Байкал, n = 2), Hucho taimen (р. Селенга, n = = 2), Brachymystax lenok (оз. Маркаколь, n = 1; р. Ингода, n = 1; р. Арму, n = 1), B. tumensis (р. Онон, n = 1; р. Комиссаровка, n = 1; р. Ана-ньевка, n = 1), Salmo trutta (р. Луга, n = 2), Parahucho perryi (р. Киевка, n = 7), Salvelinus alpinus (оз. Luomus, Финляндия, n = 3; Kanes Laddu, Финляндия, n = 3; "пучеглазка" из оз. Лама, n = 3; даватчан из оз. Фролиха, n = 3; р. Колыма, n = 2), S. leucomaenis (р. Максимовка, n = 2), S. levanidovi (р. Яма, n = 1), S. elgyticus (оз. Эльгыгытгын, n = = 2), S. boganidae (оз. Эльгыгытгын, n = 2), S. taranetzi (р. Выквынайваам, n = 1), S. malma (р. Камчатка, n = 1; руч. Вилючинский, n = 1), S. curilus (зал. Северный, n = 1; р. Тымь, n = 1; о-в Расшуа, n = 2; р. Максимовка, n = 1), Oncorhynchus masou (р. Лютога, n = 1; р. Серебрянка, n = 1), O. keta (р. Нарва, n = 1; р. Киевка, n = 2), а также O. gorbuscha (n = 1), O. nerka (n = 2), O. kisutch (n = 1), O. tschawytscha (n = 1) и Parasalmo mykiss (n = 1) из р. Камчатка.
Фрагмент, включающий большую часть второго (3') экзона гена RAG1, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции; полученный продукт очищали, секвенировали с помощью на-
ФИЛОГЕНИЯ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
677
бора Big Dye Terminator 3.1 ("Applied Biosystems", США) и разгоняли продукты реакции на автоматическом анализаторе ABI Prizm 3130 ("Applied Biosystems", США/"Hitachi", Япония) на базе Биолого-почвенного института ДВО РАН (г. Владивосток). Для амплификации и секвенирования использовали набор праймеров из работы [3], а также праймеры, разработанные нами: F2817 — GAAGCACAGCCGTCTCATCCTG и F3269 - TG-GACAARCAGCTGAGGAAGAAGA.
В результате у каждого из 62 исследованных образцов было секвенировано по 1524 пн фрагмента гена RAG1. Для большинства образцов смешанный сигнал в ABI-хроматограммах выявлен не был. Однако у 13 образцов обнаружено наложение пиков по 1-2 (в среднем — 1.6) различным нуклеотидным позициям. Такие особи рассматривались как гетерозиготные по исследованному участку гена RAG1. Всего у 62 образцов было выявлено 23 варианта гена RAG1, различавшихся недвусмысленными нуклеотидными замещениями. Как правило, каждый из 23 видов Salmonidae характеризовался одним-двумя уникальными вариантами. Исключение составили представители B. lenok и B. tumensis, неотличимые по исследованному участку гена RAG1, а также образцы S. alpinus, S. taranetzi и одна из двух особей S. elgyt-icus, имевших один и тот же вариант гена RAG1. Кроме последовательностей, полученных нами (депонированы в Genbank/NCBI под номерами GQ871466—GQ871494), в анализ были включены данные по гену RAG1 из базы Genbank/NCBI для следующих видов рыб: Thymallus thymallus (AY430214), Prosopium williamsoni (AY430213), Salmo salar (DW577969, EG768285), а также Salvelinus leucomaenis (AY380535) с Курил и Р. mykiss (NM_001124737) из Северной Америки и видов Esociformes, взятых в качестве внешних групп — Esox lucius (AY380542) и Umbra krameri (AY380547). Таким образом, для построения филогении лососевых рыб было использовано 30 вариантов последовательностей гена RAG1, представлявших 26 видов Salmonidae и 2 внешние группы.
Реконструкцию филогении Salmonidae осуществляли различными методами: 1) байесовским (BA) на основе модели нуклеотидных замещений GTR + G, отобранной программой Modeltest 3.7 [5]; 2) наибольшего правдоподобия (ML) при использовании той же эволюционной модели; 3) максимальной экономии (MP); 4) дистанционным — по алгоритму ближайшего соседства (NJ) на основе LogDet генетических дистанций.
Анализ Монте-Карло с использованием цепей Маркова (байесовский анализ филогении) выполняли с помощью программы MrBayes 3.2 [6] путем одновременного запуска шести цепей (пяти "горячих" и одной "холодной") в течение 3 х
х 106 циклов с отбором каждого пятисотого из генерированных деревьев и исключением первых 1001 из 6001 полученных деревьев (burnin = 1001).
Эвристический поиск наиболее правдоподобных или максимально экономных деревьев (ML-и MP-деревьев) проводили с помощью программы PAUP 4.0b10 [7] в 40 повторностях со случайным характером включения последовательностей в анализ и перестановками по TBR-алгоритму. Та же программа использовалась и для построения NJ-дерева. Устойчивость порядка ветвлений ML-, MP- и NJ-деревьев оценивалась методом бутстр-эпа в 1000 повторных псевдослучайных выборках.
Вне зависимости от использованного метода итоговые филогенетические деревья оказались практически одними и теми же. Топология BA-, ML- и MP-деревьев была идентичной (рис. 1), а NJ-дерево отличалось от них в двух моментах — сестринским положением Thymallus и Coregonus, а также объединением в одну группировку Parahu-cho, Salvelinus и Oncorhynchus, но бутстрэп-под-держка этих альтернативных вариантов кластеризации оказалась низкой (<50%). Принципиальное сходство результатов, полученных с помощью различных методов филогенетической реконструкции, а также высокая статистическая поддержка большинства из выявленных клад позволяют рассматривать филогенетическое дерево на рис. 1 как обоснованное.
Важно, что тест молекулярных часов, основанный на отношении оценок правдоподобия [8], показал, что скорость эволюции нуклеотидных последовательностей гена RAG1 в разных частях этого дерева относительно однородна. Различие между оценками правдоподобия, полученными для аддитивного и ультраметрического ML-дере-вьев, оказалось статистически не значимо — 2 А = = 2(—4963.02—(—4976.32)) = 26.6, Р = 0.54 при d.f. = 28 (без внешних групп — 2А = 2(—3740.08— (-3753.01)) = 25.9, Р = 0.47 при df = 26). Это свойство позволило построить ультраметрическое дерево Salmonidae, что было реализовано в рамках байесовского подхода с помощью пакета программ BEAST 1.4.8 [9] при следующих условиях: модель молекулярных часов — строгие часы; модель нуклеотидных замещений — GTR + G; протяженность байесовского анализа — 3 х 106 циклов с отбором каждого тысячного из генерированных деревьев; burnin — 601; внешние группы из рассмотрения были исключены. Для привязки ультраметрического дерева к абсолютной шкале времени было использовано два калибровочных интервала. Первый был основан на многочисленных ископаемых остатках лососевых рыб, проявляющих продвинутые черты тихоокеанских лососей рода Oncorhynchus (см.: [10], а также литературу из этой работы), и ограничивал время разделения рецентных линий Oncorhynchus ин-
678
ШЕДЬКО и др.
Ч h Ч h
Umbra krameri (AY380547)
Ч h
0.56/-/79/-
Esox lucius (AY380542) Thymallus thymallus (AY430214) Th. arcticus
0.94/73/89/68 1-Th. tugarinae
-Prosopium williamsoni (AY430213)
1/90/92/89
0.01
1/94/90/94 -
0.76/59/62/-
- Coregonus migratorius
****i-Brachymystax lenok, B. tumensis
'-Hucho taimen
- Parahucho perryi
_**** i- Salmo salar (DW577969&EG768285)
'- S. trutta
_Salvelinus leucomaenis (AY380535)
S. leucomaenis S. levanidovi - S. elgyticus S. boganidae
S. alpinus, S. taranetzi, S. elgyticus S. curilus S. curilus S. malma
^- Parasalmo mykiss (NM_001124737)
1/87/86/88 p. mykiss
- Oncorhynchus kisutch
O. tschawytscha
*_qO. masou
1/85/86/87
0.99/79/67/60 0.84/63/74/7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.