ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 4, с. 538-546
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ФИТОЭКСТРАКЦИЯ КАДМИЯ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У Solanum nigrum КАК НОВОГО ГИПЕРАККУМУЛЯТОРА © 2010 г. Ян Гао****, Пэй Чжоу*****, Лян Мао**, Ван-Цзюн Ши**, Юэ-Эр Чжи**
* Факультет науки об окружающей среде и биоинженерии, Университет Шанхая, КНР ** Факультет сельского хозяйства и биологии, Университет Шанхая, Шанхай, КНР *** Ведущая лаборатория городского земледелия (Юг), Министерство сельского хозяйства, Шанхай, КНР
Поступила в редакцию 15.10.2008 г.
До сих пор не полностью известны физиологические, биохимические и молекулярные механизмы, вовлеченные в процессы адаптации растений к неблагоприятным факторам среды и гипераккумуляцию металлов. В данной работе изучается функционирование антиоксидантной защиты и ассимиляция CO2 растениями Solanum nigrum, являющегося, как было открыто недавно, гипераккумулятором кадмия. Показано, что ингибирование роста S. nigrum, обусловленное увеличением концентрации тяжелого металла, сопровождалось снижением ассимиляции CO2 при фотосинтезе. Присутствие тяжелого металла в почве приводило к нарушению антиоксидантных систем, особенно супероксиддисмутазы, малонового диальдегида, фитохелатинов и суммы кислоторастворимых тиолов, являющимися индикаторами повышенного содержания тяжелых металлов. В то же время в активности пероксидазы в растениях S. nigrum отмечались незначительные разнонаправленные изменения, а уровень восстановленного глутатиона значительно снижался с увеличением содержания кадмия и времени выращивания. Таким образом, изменения активностей антиоксидантных ферментов увеличивают устойчивость организма.
Ключевые слова: Solanum nigrum — ферменты антиоксидантной защиты — кадмий — фотосинтез
ВВЕДЕНИЕ
Кадмий (Cd) является очень ядовитым микроэлементом, попадающим в окружающую среду, главным образом в результате производственных процессов и использования фосфатных удобрений. Он может достигать высоких концентраций в почвах сельскохозяйственных угодий и легко ассимилироваться растениями. В настоящее время в мире насчитывается более 400 видов гипераккумуляторов. Примечательно, что один за другим были успешно выявлены некоторые гипераккумуляторы кадмия, такие как Solanum nigrum [1] и Arabidopsis halleri [2], а индийская горчица (Brassica juncea) использовалась в фиторемедиации свинца и кадмия.
Токсичность кадмия предположительно связана с развитием окислительного стресса в результате повышенного образования активных форм кислорода и изменения функционирования ряда
Сокращения: ДТНБ — дитиобиснитробензойная кислота; ДТПА — диэтилтриаминпентауксусная кислота; МДА — малоновой диальдегид; ОКТ — общие кислоторастворимые тиолы; ПО — пероксидаза; СОД — супероксиддисмутаза; ССК — сульфосалициловая кислота; ФБ — фактор биоаккумулирования; ФП — фактор переноса; ФХ — фитохелатины. Адрес для корреспонденции: Pei Zhou. Shanghai Jiaotong University 1126 mail box, Dongchun Road 800, Shanghai 200240, P.R. China. E-mail: zhoupei@sjtu.edu.cn
антиоксидантных ферментов [3]. В критических стрессовых условиях антиоксидантного потенциала может быть недостаточно для минимизации негативных последствий окислительных повреждений. Выживание в стрессовых условиях зависит от способности растений воспринимать раздражитель, генерировать и передавать сигналы и индуцировать биохимические изменения для регуляции метаболизма.
Супероксиддисмутаза (СОД) участвует в реакции дисмутации супероксид-анион радикала до перекиси водорода и 02. Эти реакции носят спонтанный характер и протекают чрезвычайно быстро, защищая клетки от повреждения продуктами реакций с супероксид-анион радикалом [4].
Пероксидаза (ПО) участвует в биосинтезе лигнина и восстановлении Н202 до Н20. Способность к регуляции антиоксидантых ферментов является защитным механизмом растений против окислительного стресса [5]. Малоновый диальдегид (МДА) обычно рассматривают как показатель степени окислительного стресса растений и структурной целостности мембран в условиях низких температур [6]. Как сообщали КгаП;еу с соавт. [7], салициловая кислота оказывает благотворный эффект на процессы фотосинтеза в отношении кадмиевого стресса, однако сама по себе может служить стрессором для растения. Кро-
ме того, при фотосинтезе и дыхании в дальнейшем могут изменяться концентрации растворенного неорганического углерода и его изотопный состав.
Глутатион связывают с устойчивостью к стрессу. Этот важный антиоксидант ответственен за поддержание антиоксидантной системы клеток в стрессовых условиях. Участие фитохелатинов (ФХ) в детоксификации металлов была установлена в опытах с мутантами с дефицитом глутатио-на и ФХ [8]. Способность фитохелатинов различных растений образовать комплексы с токсичными металлами (кадмий, свинец и ртуть) считается важным механизмом их детоксификации [9]. Однако встречается ряд сообщений, что ФХ не способствуют устойчивости к Cd у растений, устойчивых к действию металлов [10]. Тем не менее, в связи с огромными различиями морфологических и таксономических признаков растений, могут различаться и механизмы их устойчивости, в том числе и роль фитохелатинов.
В связи с этим поиск сигнальных молекул, которые отвечают за устойчивость к стрессу, является необходимым условием для понимания того, как растения приспосабливаются к неблагоприятным условиям среды. Целью настоящего исследования было оценить влияние ионов Cd в почве на антиоксидантные системы (а именно, СОД, ПО, МДА, ФХ, ОКТ и глутатион) и ассимиляцию CO2 растениями S. nigrum.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Почвенные условия, отбор образцов и обработка.
В исследованиях использован поверхностный (0—20 см) слой почвы незагрязненных сельскохозяйственных угодий бассейна р. Янцзы (Шанхай, Китай, 31°02' с.ш., 121°52' в.д.). Воздушно сухую почву просеивали через сито с диаметром отверстий 4 мм, смешивали с основными удобрениями, после чего добавляли Cd. Почвенную смесь помещали в пластиковые горшки высотой 40 см и диаметром 40 см. Почва была взята с рисовых полей и характеризовалась следующими параметрами: pH 8.18, органические вещества — 16.17 г/кг, общий азот и фосфор 1.14 и 1.36 г/кг соответственно; катион-обменная способность — 15.6 смоль/кг, содержание Cd, Cu, Zn, Pb и As - 0.18, 22.9, 38.1, 15.1 и 7.4 мг/кг соответственно.
Растения выращивали в теплице Шанхайского университета при средней температуре 22-25°С. Для обработки использовали CdCl2 x5H2O; исследовали пять концентраций Cd (0, 2, 5, 10 и 25 мг/кг сухой почвы); соответствующие варианты обозначали как К, Cd-2, Cd-5, Cd-10 и Cd-25. Проростки Solanum nigrum L. двухнедельного возраста с 2-3 листьями, высотой 3-4 см были высажены в горшки (5 простков в каждом горшке). Каждый
вариант опыта имел трехкратную повторность. Растения были собраны и проанализированы после 0, 7, 14 и 35 дней выращивания, когда они достигали фазы цветения. Как было показано в работах Wei с соавт. [11] аккумулирующая способность S. nigrum на стадии цветения составляла около 83% по сравнению с закончившими рост растениями.
Образцы растений собирали, срезая побеги у поверхности почвы и тщательно отделяя корни от почвы. Растения тщательно промывали в проточной водопроводной, а затем дистиллированной воде, высушивали при 100° С в течение 10 мин, затем выдерживали в духовом шкафу при 70°С до полного высыхания.
Определение Cd. Растительные образцы подвергали влажному озолению в среде, содержавшей 87% концентрированной HNO3 и 13% концентрированной HClO4 [12]. Содержание тяжелых металлов в полученном растворе определяли на атомном адсорбционном спектрофотометре AFS820 ("Bejing Titan Instruments", Китай).
Ассимиляция CO2. Интенсивность фотосинтеза определяли во фрагментах листьев. Листовую пластинку массой 1 г нарезали перпендикулярно жилкам на 1-миллиметровые фрагменты, которые инкубировали в 25-миллилитровых колбах Эрленмейера в 5 мл буфера в течение 5 мин при интенсивности облучения 120 Вт/м2. Буфер содержал 0.33 М сорбита, 0.05 М Hepes-NaOH, 0.002 М KNO3, 0.002 М ЭДТА, 0.001 М MnCl2, 0.001 М MgCl2, 0.0005 М K2HPO4, 0.02 M NaCl и 0.2 M изоаскорбат натрия, pH 7.6. В конце периода преинкубации в каждый образец добавляли 20 мМ NaHCO3, содержавший 40 мкКи NaH14CO3 (14.3 мкКи/ммоль). После фиксации растениями 14CO2 в течение 10 мин реакцию останавливали добавлением кипящего 80% этанола. Ткани промывали восьмикратным объемом кипящего этанола такой же концентрации. Экстракты объединяли и высушивали при 40°С под вакуумом, а затем растворяли в 10 мл дистиллированной воды. Радиоактивность аликвот измеряли в 5 мл сцинтил-ляционной жидкости на жидкостном сцинтилля-ционном счетчике Tri-Carb3170TR ("PerkinElmer", США) [13].
Определение активности СОД. Образцы листьев (0.5 г) гомогенизировали в 4 объемах ледяного буфера, содержавшего 0.1 М Трис-HCl (pH 7.8), 0.1 мМ ЭДТА и 0.05% Тритон Х-100. Го-могенаты фильтровали через четыре слоя марли и центрифугировали в течение 30 мин при 15 000 g и 4°С. Грубые экстракты подвергали диализу в течение 24 ч против разбавленного вдвое буфера без Тритона X-100 и центрифугировали в течение 20 мин при 15000 g. Супернатант использовали для определения активности СОД. Реакционная смесь содержала 50 мМ фосфатный буфер (pH 7.8),
0.053 мМ ^Т, 10 мМ метионин, 0.0053 мМ рибофлавин и соответствующую аликвоту ферментного препарата. Реакцию запускали воздействием освещения и продолжали 7 мин. За одну единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50% ингибирования восстановления NBT, наблюдающегося при 560 нм (ЦУ1800, "Мараёа", Китай) [14].
Определение активности пероксидазы. Листья (0.5 г) гомогенизировали при 4° С в 3 мл 100 мМ К2НР04 (рН 7.0), содержавшего 1 мМ ЭДТА и 1% поливинилпирролидон (ПВП-40). Гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали в течение 20 мин при 15000 g. Активность измеряли изменением оптического поглощения реакционной среды (конечный объем 3 мл) при 470 нм (ЦУ1800), вызванного окислением гваякола. Реакционная среда содержала 100 мМ фосфатный буфер (рН 7.0), 20 мМ гваякол, 10 мМ Н202 и 50 мл грубого экстракт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.