научная статья по теме ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФУМАРАТГИДРАТАЗЫ В ЗЕЛЕНЫХ ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФУМАРАТГИДРАТАЗЫ В ЗЕЛЕНЫХ ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 4, с. 474-480

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

ФИТОХРОМ-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФУМАРАТГИДРАТАЗЫ В ЗЕЛЕНЫХ ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ

© 2015 г. А. Т. Епринцев, Д. Н. Федорин, О. В. Сазонова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"Воронежский государственный университет", Воронеж Поступила в редакцию 10.11.2014 г.

Выявлена зависимость активности фумаратгидратазы в зеленых листьях кукурузы (Zea mays L.) от светового режима. Установлено участие фитохромной системы в светорегуляции фумаразной активности, причем красный свет тормозил скорость функционирования фумаразы. Исследование уровня экспрессии генов fuml и fum2 в зеленых листьях показало, что активно экспрессируется только ген fuml, тогда как экспрессия гена fum2 выключается. Полученные данные свидетельствуют, что в листьях кукурузы ионы кальция могут выступать в качестве вторичного мессенджера в трансдукции светового сигнала, при этом активная форма фитохрома, образующаяся при действии красного света, вызывала накопление ионов кальция, выступающих в качестве регулятора функционирования цикла Кребса. Применение ингибитора кальциевых каналов (рутения красного) и ком-плексона (ЭГТА) позволило обнаружить, что изменение содержания свободного кальция в ядрах клеток листьев кукурузы связано с его перераспределением между компартментами клетки. Активная форма фитохрома вызывала увеличение скорости транскрипции генаpif3, при этом наблюдали ингибирование функционирования гена fuml. Предполагается, что посредником в трансдукции фитохромного сигнала в ядре может выступать транскрипционный фактор PIF3.

Ключевые слова: Zea mays — фумаратгидратаза — ферментативная активность — экспрессия гена — фитохромная система — сигнализация — катионы кальция — транскрипционный фактор PIF3

Б01: 10.7868/80015330315040077

ВВЕДЕНИЕ

Фумараза (фумаратгидратаза, КФ 4.2.1.2) катализирует обратимое превращение малата и фу-марата. Для большинства организмов роль фумаратгидратазы (ФГ) сводилась к ее участию в работе цикла трикарбоновых кислот в митохондриях [1]. Однако в растениях АгаЫйор$15 было выявлено наличие цитозольной формы; в них были обнаружены гены, кодирующие и мито-хондриальную (Л12§47510), и цитозольную фу-маразу (Л15§50950) [2]. Кроме того, обнаружили несколько метаболических функций этого фермента [3]. В частности, сообщается о важной роли цитозольной формы фумаразы в метаболизме азота [2]. ФГ может использовать фумарат, образующийся в реакции, катализируемой аргинин-сукцинат-лиазой, находящейся в цитозоле [4] или пластидах [5]. Фумараза была также обнаружена во внеклеточной среде культуральных кле-

Сокращения: КС — красный свет; ДКС — дальний красный свет; СДГ — сукцинатдегидрогеназа; ФГ — фумаратгидратаза. Адрес для корреспонденции: Епринцев Александр Трофимович. 394006 Воронеж, Университетская пл., 1. Воронежский государственный университет, кафедра биохимии и физиологии клетки. Электронная почта: bc366@bio.vsu.ru

ток моркови [6], где она принимает участие в утилизации малата. Двойная локализация и двойная функция ФГ были подтверждены сначала в клетках животных, позже подобная информация стала появляться и для растений [7, 8].

В настоящее время известно, что цикл Кребса в листьях растений ингибируется на свету. Об этом сообщалось в наших работах на примере маркерного фермента этого пути — сукцинатдегидрогена-зы (СДГ) [9]. Неоднозначна роль других ферментных систем в световой регуляции ЦТК. Экспрессия многих генов, кодирующих различные ферменты, участвующие в фотосинтетическом и дыхательном метаболизме, регулируется светом. Данный факт установлен для таких ферментов, как ротенон-нечувствительные НАДН- и НАД(Ф)-•Н-дегидрогеназы и альтернативная оксидаза, которые стимулируются светом, а также сукцинатде-гидрогеназа, пируватдегидрогеназа, цитохромок-сидаза и фумаратгидратаза, у которых активность на свету снижается [10—12]. Следовательно, свет ингибирует цикл трикарбоновых кислот и мито-хондриальную ЭТЦ, в то время как несопряженные пути активируются [12].

ФИTОХPОM-ЗAВИСИMAЯ РЕГУЛЯЦИЯ AKTИВНОСTИ ФУMAPATГИДPATAЗЫ

475

Имеются сообщения о существовании фоторегуляции фумаратгидратазной активности в листьях растений, однако неизвестен механизм трансдукции светового сигнала. Важную роль в этих процессах может играть фитохромная система, оказывающая свое влияние на функционирование ферментов через различные вторичные мессенджеры, такие как ионы Са2+, G-белки и цAMФ [13]. Ранее было установлено, что фито-хромная система участвует в регуляции некоторых дыхательных ферментов на уровне экспрессии их генов [10, 14, 15]. Кроме того, важная роль в регуляции экспрессии генов, кодирующих све-тозависимые ферменты, по мнению некоторых авторов, принадлежит транскрипционным факторам семейства PIF (PIF1—PIF5) [16, 17].

Поэтому заслуживающей внимания проблемой представляется исследование роли фито-хромной системы растений в работе ферментов цикла трикарбоновых кислот, в частности, фума-ратгидратазы. Данные об активности ФГ позволяют судить о скорости функционирования цикла Кребса, причем характеризовать функционирование этого фермента можно не только по энзиматической активности, но и по экспрессии гена, кодирующего его белковую молекулу. В связи с этим целью настоящего исследования было выяснение роли фитохромной системы в транс-дукции светового сигнала, обуславливающего фоторегуляцию фумаратгидратазной активности в зеленых листьях кукурузы.

MATEPИAЛЫ И METОДЫ

В качестве объекта исследования использовали зеленые листья 14-дневных растений кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская 76, выращенных гидропонным способом при 10-часовом световом дне, температуре 250С и интенсивности света 25 Вт/м2.

Для создания различного светового режима растения помещали в темную камеру на 24 ч (вариант "темнота") и облучали красным (вариант КС) и/или дальним красным (варианты КС + ДКС или ДКС) светом в течение 15 мин. Для этого использовали светодиоды с областью испускания 640— 6B0 нм (KH^40M40-K^6, Россия) и 710-750 нм (3Л127A-5, Россия). Пробы для дальнейшего анализа отбирали через 3 ч с момента облучения.

Aктивность ФГ измеряли спектрофотометриче-ски по снижению оптической плотности при длине волны 240 нм при 250С. Состав среды: 50 мM Tris— HCl (pH B.0), 50 мM малат, 3 мM MgSO4. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин при 250С в расчете на 1 г сырой массы.

Общее количество белка определяли по методу Lowry с соавт. [18].

Фракции ядер из растительного материала выделяли по методике, предложенной Lee и Lin [19].

Количество свободного кальция определяли спектрофотометрическим методом по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина. Mурексид образует с кальцием окрашенный комплекс, устойчивость которого повышается путем добавления в раствор глицерина [20]. Расчет концентрации кальция проводили по калибровочному графику.

Перекрестное загрязнение определяли по активности цитоплазматических маркерных ферментов. Aктивность алкогольдегидрогеназы определяли спектрофотометрически по скорости восстановления НAД+ при 340 нм в присутствии 150 мM этанола [21]. Aктивность лактатдегидроге-назы измеряли при помощи оптического теста Варбурга [22], используя в качестве субстрата 1 мM пируват натрия.

При изучении действия ингибитора кальциевых каналов (рутения красного) и комплексона ^FTA) растения кукурузы перед началом эксперимента выдерживали в 25 мM растворе рутения красного или 5 мM растворе ЭГ^ в течение 2 ч [23].

Для выделения суммарной клеточной РНК использовали набор Magna RNA Prep 100 ("Aмпли-сенс", Россия), согласно рекомендациям производителя.

Обратную транскрипцию РНК осуществляли с использованием обратной транскриптазы вируса Moloney лейкоза мышей M-MULVRT ("Fermentas", Литва) для синтеза первой цепи кДНК.

ПЦР в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 ("Bio-Rad", СШA), используя в качестве красителя SYBR Green. В качестве праймеров, подобранных с помощью программного обеспечения Primer3, использовали нуклеотидные последовательности к гену fum 1: прямой 5'-gattacttcgatcat-tgaggt-3' и обратный 5'-accagaactcgcggatgtggc-3', и к гену fum 2: прямой 5'-acaaacttgccattcgtcacc-3' и обратный 5'-tggttcattctcaggcagaga-3'.

Параметры амплификации: предварительная денатурация — 950С, 5 мин; цикл — 950С, 30 с, 600С, 30 с, 720С, 30 с (детекция); финальная элонгация — 720С, 10 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-la с ген-специфичными праймерами [24]. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без проведения обратной транскрипции.

Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2—ААС(-метода с использованием программного обеспечения Opticon Monitor™ Software ("BioRad").

л „ о Л о Ч се Р 2

М' %

1-Т

е

л м

Н Я

о 3 о %

у £ р

с

0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0

к 0.5 1 2 3 6 9 Время нахождения в темноте, ч

Рис. 1. Динамика активности фумаратгидратазы в листьях 14-дневных растений кукурузы при изменении светового режима.

К — растения, экспонируемые на свету с интенсивностью 25 Дж/(м2 с); 0.5, 1, 2, 3, 6, 9 — время инкубации растений в темноте (ч).

а н е

1-1

я и

о о

е р

С

о

к

т

1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Свет Темнота КС

ДКС КС + ДКС

Рис. 3. Относительный уровень транскрипции гена /ыт1 в листьях кукурузы при разных световых режимах.

Свет — растения, освещенные белым светом; темнота — растения, выдержанные в темноте; КС — растения, освещенные светом с длиной волны 660 нм; КС + ДКС — растения, последовательно освещенные светом с длиной волны 660 и 730 нм.

Полученные данные обрабатывали с использованием статистического критерия Стьюдента. Обсуждаются статистически достоверные различия при Р < 0.05 [25].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение динамики активности ФГ в зеленых листьях кукурузы при помещении растений в темноту показало, что в первые 0.5 ч происходило резкое возр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком