МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 19-24
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.222:577.114
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРОБНОГО ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА ЭТАПОЛАНА, СИНТЕЗИРОВАННОГО НА СМЕСИ РОСТОВЫХ СУБСТРАТОВ
© 2004 г. Т. П. Пирог, М. А. Коваленко, Ю. В. Кузьминская, С. К. Воцелко
Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук Украины, Киев
Поступила в редакцию 26.11.02 г.
Изучены физико-химические свойства микробного экзополисахарида (ЭПС) этаполана, синтезированного при выращивании продуцента Acinetobacter sp. 12S на смеси этанола и глюкозы, а также на моносубстратах. Установлено, что независимо от природы источника углеродного питания ЭПС характеризовались одинаковым содержанием в их составе углеводов, пировиноградной, уроновых кислот и минеральных компонентов. Исследуемые ЭПС были идентичны также по моносахаридно-му составу: молярное соотношение глюкозы, маннозы, галактозы и рамнозы составляло 3 : 2 : 1 : 1. При культивировании продуцента на смеси субстратов синтезировался ЭПС с более высоким содержанием жирных кислот, чем на моносубстратах. Средняя молекулярная масса, а также содержание в ЭПС высокомолекулярных фракций (больше 2 млн.) было выше у этаполана, полученного на смеси этанола и глюкозы. Растворы такого ЭПС характеризовались более высокой вязкостью в присутствии 0.1 М KCl, при переводе в Н+-форму и системе Си2+-глицин, чем ЭПС, синтезированные на моносубстратах. Обсуждаются причины улучшения реологических свойств ЭПС, полученного на смешанном субстрате.
Ключевые слова: экзополисахариды, условия культивирования, смешанный субстрат, химический состав, молекулярная масса, реологические свойства.
Ранее нами была показана возможность увеличения синтеза микробного экзополисахаридно-го препарата (ЭПС) этаполана при выращивании Acinetobacter ер. 12Б на смеси этанола и глюкозы [1]. Установлены условия культивирования продуцента, позволяющие интенсифицировать синтез ЭПС на смеси двух энергетически-неравноценных субстратов [2]. Показано, что наиболее высокая эффективность трансформации углерода субстратов в ЭПС обеспечивалась при отсутствии в среде катионов натрия, снижении концентрации источника азотного питания до 0.3-0.45 г/л, использовании посевного материала, выращенного на этаноле. Культивирование продуцента в таких условиях сопровождалось также увеличением максимальной удельной скорости роста и смещением времени ее достижения в более раннюю ростовую фазу [2].
Однако известно, что условия культивирования продуцента влияют не только на синтез ЭПС (количество синтезированных полисахаридов, скорость их образования, выход ЭПС от субстрата и др.), но также и на физико-химические свойства конечного продукта [3-8]. В различных условиях выращивания может изменяться химический состав ЭПС, их молекулярная масса, соотношение нескольких полисахаридов, что влияет на реологи-
ческие свойства ЭПС, определяющие практическую значимость этих полимеров.
В связи с этим цель настоящей работы состояла в исследовании химического состава, молекулярной массы и реологических свойств этаполана, синтезированного на этаноле, глюкозе и смеси этих субстратов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследований. Объектом исследований являлся штамм Acinetobacter ер. 12Б - продуцент комплексного полисахаридного препарата этаполана, описанный нами ранее [5].
Культивирование АстеЬоЪасЬвт эр. 128. Бактерии выращивали на жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): КН2Р04 - 6.8; КОН -1.8; Ш4ЧЮ3 - 0.3; М§Б04 ■ 7Н20 - 0.4; СаС12 ■ 2Н20 -0.1; Ре804 ■ 7Н20 - 0.001. В среду дополнительно вносили 0.5% (по объему) дрожжевого автолиза-та и 0.0006% пантотената кальция. В качестве источника углерода и энергии использовали этанол в концентрации 1.0% (по объему), глюкозу в концентрации 1.0% (масс.), а также смесь этих субстратов в соотношении 1 : 1 (% этанола по объему : : масс. % глюкозы). При выращивании бактерий
19
2*
на смешанном субстрате концентрация этанола составляла 1% (по объему), глюкозы - 1% (масс.).
В качестве посевного материала использовали культуру из экспоненциальной фазы (16-24 ч роста), выращенную на минеральной среде указанного выше состава, содержащую 0.5% (по объему) этанола. Концентрация посевного материала составляла 5% от объема засеваемой среды. Содержание КН4К03 в среде культивирования бактерий при получении инокулята составляло 0.6 г/л.
Бактерии культивировали в колбах на качалке (220 об/мин) при 30°С, рН 6.8-7.0 в течение 96 ч.
Выделение нативного этаполана. Культураль-ную жидкость, содержащую этаполан, диализо-вали против дистиллированной воды в течение 5 сут, далее разбавляли дистиллированной водой в 3-5 раз, центрифугировали для отделения клеток продуцента (12000 g, 40 мин.). Супернатант концентрировали в вакууме (50°С) до первоначального объема, после чего осаждали этаполан добавлением 1.5 объемов изопропанола. Осадок ЭПС промывали в чистом изопропаноле и высушивали при комнатной температуре.
Получение дезацилированного этаполана. Для дезацилирования к 0.15% раствору нативного этаполана добавляли боргидрид натрия и твердый КаОН из расчета 10 и 500 мг соответственно на 100 мг ЭПС, выдерживали при периодическом перемешивании в течение 48 ч при комнатной температуре, после чего нейтрализовали раствор концентрированной соляной кислотой и осуществляли пятикратную экстракцию жирных кислот гексаном.
Для выделения дезацилированного этаполана к водному раствору, полученному после экстракции жирных кислот, добавляли изопропанол, осадок ЭПС растворяли в дистиллированной воде и диализовали против дистиллированной воды в течение 5 сут, после чего концентрировали в вакууме и осаждали дезацилированный ЭПС изопропа-нолом. Осадок промывали в чистом изопропаноле и высушивали при комнатной температуре.
Определение химического состава этаполана. Химический состав нативного и дезацилированного этаполана (содержание углеводов, пирови-ноградной (ПВК), уроновых (УК) и жирных (ЖК) кислот, а также моносахаридный состав) анализировали как описано в работе [9].
Для определения содержания минеральных компонентов (МК) в составе этаполана навеску ЭПС (около 100 мг), взятую на аналитических весах, растворяли в дистиллированной воде, добавляли к раствору катионит КУ-2-8 (Н+) (из расчета 1 г смолы на 100 мг ЭПС). Обработку раствора этаполана катионитом проводили до достижения постоянного значения рН. Катионит отделяли центрифугированием (8000 g, 15 мин.), из супернатанта осаждали Н+-ЭПС добавлением 2 объемов изо-
пропанола. Осадок Н+-ЭПС промывали в чистом изопропаноле, высушивали при комнатной температуре, после чего взвешивали на аналитических весах. Содержание минеральных компонентов в составе этаполана определяли как разницу навесок исходного ЭПС и Н+-ЭПС, отнесенную к навеске исходного ЭПС.
Содержание углеводов, ПВК, УК, ЖК и МК в составе ЭПС выражали в процентах к весу условно сухого вещества. За условно сухое принимали вещество, не теряющее веса при высушивании в вакууме при 40°C.
Определение молекулярной массы ЭПС. Мо-
лекулярно-массовый состав ЭПС определяли при помощи разработанного нами метода аналитического градиентного центрифугирования [10]. В качестве стандартов использовали декстраны фирмы "Fluka" с молекулярной массой 13.5; 20; 40; 70; 110; 500 тыс. Да и 2 млн. Да. Содержание углеводов в полученных после градиентного центрифугирования фракциях (объем 1 мл) определяли по реакции с фенолом и серной кислотой [11].
Содержание компонентов определенной молекулярной массы устанавливали, определяя количество углеводов в соответствующих фракциях, и выражали в процентах к исходному (общему) количеству углеводов. Зная процентное содержание в составе ЭПС компонентов различной молекулярной массы, рассчитывали среднюю молекулярную массу.
Для определения молекулярной массы использовали упаренные концентраты ЭПС (без осаждения изопропанолом и высушивания).
Исследование реологических свойств растворов этаполана. Свойства растворов этаполана определяли по изменению их вязкости в присутствии 0.1 М KCl, при рН 4-4.5 (при условии перевода ЭПС в Н+-форму), а также в системе Cu2+-глицин как описано в работе [12]. Указанные реологические свойства определяют практическую значимость этого ЭПС [5].
Исследовали реологические свойства 0.03%-ных (по углеводам) растворов этаполана, полученных на каждом из 4 этапов его выделения и очистки (культуральная жидкость до диализа, культуральная жидкость после диализа, упаренный концентрат, после осаждения изопропанолом и высушивания).
При сравнении реологических свойств растворов этаполана, синтезированного в различных условиях культивирования, как критерий оценки использовали относительное увеличение вязкости его растворов, которое определяли по формуле:
Относительное увеличение вязкости =
= ТЪ~Г|() х 100%, По
Таблица 1. Химический состав нативного и дезацилированного этаполана, синтезированного на средах с различными источниками углеродного питания
Источник
Содержание в ЭПС, % к весу условно сухого вещества
углеродного питания Нативный ЕПС Дезацилированный ЭПС
Углеводы ПВК УК ЖК МК Углеводы ПВК УК МК
Этанол + + глюкоза Глюкоза Этанол 44.5 ± 0.5 45.0 ± 0.5 43.2 ± 0.5 3.6 ± 0.2 3.8 ± 0.2 3.7 ± 0.2 6.7 ± 0.2 8.0 ± 0.2 7.7 ± 0.2 9.4 ± 0.1 6.4 ± 0.2 6.8 ± 0.2 24.3 ± 0.4 27.4 ± 0.4 28.6 ± 0.2 60.0 ± 0.4 56.0 ± 0.5 59.1 ± 0.5 4.3 ± 0.2 4.9 ± 0.1 4.4 ± 0.2 22.2 ± 0.1 25.5 ± 0.5 22.0 ± 0.2 3.5 ± 0.2 3.3 ± 0.2 3.9 ± 0.2
Примечание. ПВК - пировиноградная кислота, УК - уроновые кислоты, ЖК - жирные кислоты, МК - минеральные компоненты.
где: п1 - вязкость раствора ЭПС в исследованных условиях (в присутствии 0.1 М KCl, в Н+-форме, в системе Си2+-глицин); По - вязкость раствора ЭПС в дистиллированной воде. Вязкость растворов этаполана измеряли на стеклянном капиллярном вискозиметре Оствальда при 20°С.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по Лакину [13]. Результаты исследований согласно t-критерию Стьюдента оказались статистически достоверными при 5%-ном уровне значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Химический состав нативного и дезацилиров
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.