ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 338-346
УДК 579.22:579.842.16:579.852.11
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНОЙ АССОЦИАЦИИ Klebsiella terrigena E6 И Bacillus firmus E3
© 2007 г. Ä. К. Злотников*, М. Л. Казакова*, К. М. Злотников*, Ä. В. Казаков**,
М. М. Умаров***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
Пущино, Московская обл., 142290 **Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл., 142290 ***Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва, 119899
e-mail: volosina@rambler.ru Поступила в редакцию 3.04.2006 г.
Изучали физиологические и биохимические свойства естественной ризосферной бактериальной ассоциации Klebsiella terrigena E6 и Bacillus firmus E3. Показано, что ассоциация активно фиксирует молекулярный азот со скоростью 110 нмоль этилена/мг белка ч. Изучена динамика численности бактерий в составе ассоциации и чистых культурах. Свойства ассоциации зависели от соотношения ее компонентов, максимум азотфиксации наблюдался при содержании B. firmus E310 - 15% от общего числа клеток. Установлено, что основой устойчивости ассоциации является специфическое взаимодействие ее компонентов через метаболиты - фенол, иара-оксибензойную кислоту, а также через азотфиксацию, дыхание и рН среды. Представлена схема взаимодействия компонентов ассоциации.
В мире ежегодно растет потребление азотных удобрений, производство которых требует огромных затрат. Еще не в полной мере используется потенциал биологической фиксации азота, притом, что суммарная годовая продукция азотфиксации в наземных экосистемах оценивается в 175190 млн. т/год [1]. Особенно перспективным в этой связи представляется использования возможностей ассоциативной азотфиксации, которая по сравнению с симбиотической азотфиксацией еще сравнительно мало изучена. К ассоциативным азотфиксаторам относятся представители родов Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Bacillus, Xan-thomonas, Derxia и др., обитающие в ризосфере и филлосфере растений [2]. Высокая плотность микробного населения в ризосфере (до десятков миллиардов клеток/г почвы) заставляет предположить, что значительную роль в функционировании ризосферных ассоциативных азотфиксаторов играют межмикробные взаимодействия. Действительно, еще в 1967 г. из ризосферы были выделены первые сообщества (ассоциации) ассоциативных азотфиксаторов [1].
Микробные ассоциации широко распространены в природе, в том числе в почве, и представляют собой один из наиболее перспективных объектов исследований. Ассоциации микроорганизмов способны более гибко реагировать на экологические факторы, полнее использовать потоки энергии и глубже утилизировать субстраты, чем чистые культуры [3]. Имеются многочис-
ленные экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что азотфиксирующая активность бактерий в ассоциациях увеличивается по сравнению с чистыми культурами. Так, например, штамм Cellulomonas sp. CS 1-17, способный разлагать целлюлозу в ассоциации с Azospirillum brasilense в микроаэрофильных условиях, повышает в несколько раз активность азотфиксации у азоспириллы при росте на соломенном компосте. Азотфиксация при этом возрастает до 72 мг азота/г соломы [4]. Из ризосферы мангров была выделена азотфиксирующая ассоциация A. brasilense и Staphylococcus sp. [5]. Стафилококк не фиксировал азот, однако в несколько раз увеличивал нит-рогеназную активность азоспириллы. Аналогично живым бактериям действовала бесклеточная культуральная жидкость стафилококка. Добавление убитых клеток Staphylococcus sp. к суспензии A. brasilense не вызывало усиления азотфиксации, что позволило сделать вывод о действии прижизненных метаболитов. В составе культу-ральной жидкости стафилококка были обнаружены аспарагиновая, янтарная и другие органические кислоты. Их внесение в чистом виде усиливало азотфиксацию, но в меньшей степени, чем живые клетки ассоцианта. Подобные ассоциации, состоящие из азотфиксатора и усиливающего азотфиксацию штамма-'регулятора", по-видимому, широко распространены в ризосфере, в пользу чего свидетельствуют многочисленные сообщения об их выделении. В частности, из ри-
зосферной почвы была выделена тройная ассоциация, состоящая из азотфиксаторов Listionella an-guillarum и Vibrio campbelli, и регуляторного штамма Staphylococcus sp. [6]. Как и в предыдущем случае, суспензия и культуральная жидкость стафилококка усиливали азотфиксирующую активность диазотрофов (на 20%). Очевидно, что с использованием ассоциаций вклад ассоциативных азотфиксаторов в снабжение сельскохозяйственных растений биологическим азотом может быть значительно увеличен, однако микробные азотфиксирующие ассоциации к настоящему времени изучены еще в недостаточной степени.
Объект наших исследований - бактерия Klebsiella terrigena E6 известна как активный ассоциативный азотфиксатор. Ее азотфиксирующая активность (АФА) составляет в аэробных условиях на безазотной среде 25 нмоль этилена/мг белка ч. K. terrigena E6 была выделена в составе ассоциации с Bacillus firmus E3 из ризосферной почвы (серая лесная среднесуглинистая) ежи сборной (Dactylis glomerata). Бацилла обнаруживала активность азотфиксации, близкую к нулю, как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Однако при добавлении суспензии B. firmus E3, АФА у клебсиеллы возрастала с 25 до 110 нмоль этилена/мг белка ч, т.е. наблюдался ассоциативный эффект - явление резкого значительного увеличения активности в ассоциации по сравнению с чистыми культурами. В наших предварительных исследованиях было установлено, что в анаэробных условиях нитроге-назная активность K. terrigena была заметно выше, чем в присутствии кислорода (465 нмоль этилена/мг белка ч), однако ассоциативный эффект отсутствовал [7].
Цель работы - изучение физиологических, биохимических свойств и закономерностей взаимодействия компонентов естественной ризосферной бактериальной азотфиксирующей ассоциации K. terrigena E6 и B. firmus E3. В процессе работы изучали рост бактерий K. terrigena E6 и B. firmus E3 при совместном и раздельном культивировании в жидкой периодической культуре, активность азотфиксации, дыхания и выделения СО2. Характеризовали состав культуральной жидкости бактерий и ее влияние на азотфиксацию.
МЕТОДИКА
Культивирование бактерий. Коллекцию бактерий поддерживали на агаризованной среде IPG-05 [8]. Для измерения активности азотфиксации в суспензиях Klebsiella terrigena E6 и Bacillus firmus E3 бактерии выращивали на модифицированной безазотной среде Доберейнер NFb, имитирующей естественное минеральное питание в ризосфере, следующего состава (г/л): D, L-яблочная кислота -5.00, K2HPO4 - 0.50, MgSO4 ■ 7H20 - 0.20, NaCl -0.10, CaCl2 ■ 2H20 - 0.02, глюкоза - 3.00, раствор
микроэлементов - 2 мл, раствор витаминов -1 мл; pH среды доводили KOH до 6.8 [9]. Состав раствора микроэлементов (мг/л): ЭДТА - 500, FeSO4 ■ 7H20 - 1500, ZnSO4 ■ 7H20 - 400, MnCl2 ■ ■ 4H 0 - 1000, H3B03 - 500, CoCl2 ■ 6H20 - 300, CuSO4 ■ 5H20 - 100, NiCl2 ■ 6H20 - 20, KI - 20, Na2MoO4 ■ 2H20 - 500. Состав раствора витаминов (мг/л): пантотенат Ca - 1000, тиамин - 400, биотин -500.
При приготовлении обеих сред, стерильные растворы Ca, Mg и глюкозы добавляли после ав-токлавирования во избежание выпадения осадка. Для приготовления твердых сред добавляли 20 г/л агара. Для отмывания от питательной среды бактерии дважды центрифугировали (15 мин, 5000 g) и ресуспендировали в стерильном фосфатном буфере (мг/л): KH2PO4 - 134, Na2HPO4 - 266, NaCl - 5000.
Определение активности азотфиксации в суспензиях (in vitro). Микроорганизмы выращивали на жидкой среде Доберейнер NFb в стерильных пробирках. Использовали бактерии либо взятые из жидкой периодической культуры при выращивании в колбах с 250 мл среды на качалке (180 об/мин) при 28°С, либо суспендированные в свежей жидкой среде из 1-суточных колоний на агаризованной среде IPG-05. Титр суспензий составлял около 106 КОЕ/мл. В каждую пробирку помещали по 3 мл суспензии в 2 приема: 1.5 и 1.5 мл. Первая часть - суспензия K. terrigena E6, состав второй зависел от цели конкретного опыта. Это была либо также суспензия K. terrigena E6 (тогда получалась чистая культура), либо суспензия B. firmus E3 в разных разведениях (ассоциация с различным начальным соотношением компонентов), либо растворы веществ, действие которых изучалось на азотфиксацию K. terrigena E6 (фенол, пара-оксибензойная кислота).
Определение активности азотфиксации в микро-аэрофильных условиях. Культуры выращивали на среде Доберейнер NFb без перемешивания. Перед введением ацетилена в пробирки воздух замещали аргоном. Для создания анаэробных условий культуры выращивали на предварительно прокипяченной жидкой среде с индикатором окислительно-восстановительного потенциала, в закрытых стерильными резиновыми пробками и металлическими зажимами флаконах, в атмосфере Ar : N2 = 1 : 1.
Суспензию бактерий брали для анализов на 0, 1, 2, 3, 4, 5 и 9 сут после засева из жидкой периодической культуры на среде Доберейнер NFb. После анализа определяли содержание белка в суспензии по Лоури.
Измерения АФА проводили ацетиленовым методом [11] на 4 сут после засева (в экспоненциальной фазе роста), когда азотфиксирующая активность K. terrigena была максимальной. Пробирки герметично закрывали резиновыми пробками,
вводили 1 мл ацетилена и инкубировали 90 мин при 28°С. Инсулиновым шприцем из пробирки отбирали пробу 1 мл, количество образующегося этилена измеряли на газовом хроматографе Chrom-41 (Чехословакия) с пламенно-ионизационным детектором. Длина колонки 2.20 м, наполнитель Spherosil; температура термостата 20°С, в качестве газа-носителя использовали аргон со скоростью потока 50 см3/мин.
Дыхание. Определения проводили полярографическим методом [10]. Для создания нулевой концентрации кислорода при калибровке прибора использовали дитионит. 100 %-ную растворимость кислорода в используемых средах при 20°С принимали равной 250 мкМ [12]. Использовали ячейку с платиновым электродом, объем пробы 1 мл. Активность потребления кислорода выражали в мкмоль O2/мг белка ч.
С02. Выделение углекислого газ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.