научная статья по теме ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОТВЕТЫ РАСТЕНИЙ АРАБИДОПСИСА НА ИЗБЫТОК МЕДИ И ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА Биология

Текст научной статьи на тему «ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОТВЕТЫ РАСТЕНИЙ АРАБИДОПСИСА НА ИЗБЫТОК МЕДИ И ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 6, с. 906-916

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОТВЕТЫ РАСТЕНИЙ АРАБИДОПСИСА НА ИЗБЫТОК МЕДИ И ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА

© 2009 г. М. Войчик*, Б. Павликовская-Павлега**, А. Тукиендорф*

* Кафедра физиологии растений, Университет им. М. Кюри-Складовской, Люблин, Польша ** Кафедра сравнительной анатомии и антропологии, Университет им. М. Кюри-Складовской, Люблин,

Польша Поступила в редакцию 20.03.2008 г.

Исследовали ответные реакции растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (экотип Colombia) на избыток Cu при измененном внутриклеточном содержании восстановленного глутатиона (GSH). Добавление в питательный раствор бутионин-сульфоксимина (БСО, 500 мкМ) снижало содержание внутриклеточного GSH, а экзогенный GSH (500 мкМ) повышал его. Увеличение концентрации Cu от 5 до 50 мкМ приводило к уменьшению содержания GSH в корнях, но повышало в побегах. БСО не подавлял рост растений, в отличие от экзогенных GSH и Cu, сильно снижавших накопление сырого вещества. Обработка Cu в сочетании с БСО или GSH вызывала изменения в структуре корня и ультраструктуре хлоропластов листа. Обработка Cu не приводила к накоплению фитохелатинов. Обработка растений БСО или GSH практически не влияла ни на уровень GSH в растениях, обработанных Cu (за исключением вариантов Cu/GSH 50/50 и 50/500 мкМ/мкМ, когда в корнях внутриклеточное содержание GSH увеличивалось), ни на токсичность Cu для растений. Полученные результаты показали, что GSH не принимал прямого участия в детоксикации Cu и устойчивости A. thaliana к Cu, но влиял на анатомическую структуру растений.

Ключевые слова: АтаЫйорз18 ТНаНапа - медь - глутатион - структура корня и листа - ультраструктура хлоропласта

ВВЕДЕНИЕ

Медь - микроэлемент, необходимый для жизнедеятельности организмов. В растениях медь является каталитическим кофактором в таких биологических процессах, как дыхание, фотосинтез, транспорт железа, фиксация азота, защита от окислительного стресса, рост и развитие [1]. Однако, благодаря своей химической активности, ионы меди могут оказывать отрицательный эффект, если клетка не справляется с их детоксика-цией. Если в нормальных условиях свободная медь не обнаруживается в клетке, то при избытке ионов Си свободные катионы вызывают серьезные нарушения в метаболизме растения. Одной из основных причин таких нарушений является образование медью радикалов гидроксила, которые взаимодействуют с тиоловыми группами белков, разрушая их вторичную структуру, а также вызывают деградацию липидов и нуклеино-

Сокращения: БСО - бутионин-сульфоксимин; МТ - метал-лотионеин; ФХ - фитохелатин; GSH - восстановленный глутатион; GSSG - окисленный глутатион.

Адрес для корреспонденции: M. Wojcik. Department of Plant Physiology, Maria Curie-Sk-todowska University, Akademicka 19, 20-033 Lublin, Poland. Fax: +48 81 537 59 01; e-mail: mwojcik@ poczta.umcs. lublin.pl

вых кислот. Как результат вышеперечисленного, ингибируются многочисленные метаболические процессы, повреждается структура клеток и тканей, наступает задержка роста и старение [1-3]. Растения весьма чувствительны к негативному влиянию меди, и ее вредное действие проявляется при концентрации, лишь слегка превышающей оптимальную.

Поскольку медь является токсичным, но необходимым для жизнедеятельности микроэлементом, растения должны, с одной стороны, доставлять этот элемент к нуждающимся в нем частям растения и компонентам клетки, но с другой стороны, предотвращать его токсическое действие. В последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании того, как медь транспортируется в клетку и распределяется в ней [2]. Однако механизмы устойчивости к супероптимальным концентрациям меди еще предстоит исследовать. Широко распространенными механизмами устойчивости растений к Си являются предотвращение избыточного поглощения и транспорта меди, а также задержка поступившей меди в корнях, т.е. блокировка ее транслокации в побеги [4].

На клеточном уровне устойчивость к Си может быть достигнута путем иммобилизации кати-

онов металла в клеточной стенке, депонирования в вакуолях или связывания их с органическими хелаторами, которые обладают высоким сродством к меди, например, с карбоксильными и фе-нольными азотсодержащими соединениями. Ме-талл-связывающие соединения, металлотионеи-ны (MT) и фитохелатины (ФХ), вызывают особенный интерес из-за своей способности к де-токсикации меди [4, 5]. Во многих исследованиях показано, что экспрессия некоторых генов, кодирующих МТ, индуцируется в присутствии меди, а также, что MT вовлечены в процессы устойчивости к Cu и поддержания гомеостаза в растениях [5]. Однако относительно активации Cu ФХ получены противоречивые данные [6].

ФХ относятся к семейству пептидов, содержащих многократные (от 2 до 11 раз) дипептидные (у-Глу-Цис) повторы с Глу на С-конце. ФХ структурно близки к восстановленному глутатиону (GSH), который служит предшественником их синтеза. ФХ образуют комплексы с катионами тяжелых металлов в цитоплазме и транспортируют их в вакуоль для хранения. Показано, что ФХ играют важную роль в детоксикации кадмия и устойчивости к тяжелым металлам у многих видов растений, включая Arabidopsis thaliana [4, 5]. Медь способна активировать биосинтез ФХ и связываться с ними в устойчивые комплексы как в условиях in vivo, так и in vitro [5].

Глутатион - один из наиболее распространенных тиолов небелковой природы в живых клетках. Нуклеофильная активность глутатиона находит свое применение во многих физиологических процессах, таких как хранение и транспорт восстановленной серы, регуляция экспрессии генов, синтез пептидов и ДНК, регуляция клеточного цикла и антиоксидантная защита, а также в ответных реакциях на воздействие внешней среды (ксенобиотики, патогены, засуха, атмосферное загрязнение и тяжелые металлы) [7]. Помимо биосинтеза ФХ, GSH может способствовать другим механизмам устойчивости к тяжелым металлам. Например, глутатион образует в цитозоле комплексы с ионами металлов, которые могут активировать синтез ФХ, переносить ионы металла на ФХ или транспортировать их в вакуоль. GSH в аскорбат-глутатионовом цикле нейтрализует АФК, образующиеся при воздействии тяжелых металлов на клетку, превращаясь при этом в окисленный глутатион (GSSG). Когда уровень GSH в клетке снижается (из-за расхода на синтез ФХ, связывания металлов или окисления), клетка инициирует биосинтез GSH de novo из имеющихся аминокислот, чтобы поддержать его на необходимом уровне. Предполагается, что и имеющийся уровень GSH, и эффективность его возобновления после истощения могут влиять на степень устойчивости клеток к стрессам [7]. Ранее было показано, что уменьшение эндогенного уровня

GSH в мутантах или трансгенных растениях ослабляет устойчивость к тяжелым металлам [8, 9]. Однако для трансгенных растений с высоким содержанием GSH его защитная роль считается спорной. Как сообщается в ряде исследований, у некоторых видов растений повышенный уровень GSH снижал стрессовое воздействие тяжелых металлов [10], но в других случаях он не оказывал влияния [9] или даже усиливал окислительные повреждения [11].

Ранее мы продемонстрировали реакции A. thaliana на широкий спектр концентраций меди в условиях кратковременного и длительного воздействия [12]. Цель этой работы - исследовать реакции растений дикого фенотипа A. thaliana на избыток Cu в условиях измененного внутриклеточного уровня GSH. Для этого в среду культивирования с контрольными и обработанными медью растениями добавляли бутионин-сульфокси-мин (БСО, ингибитор синтеза GSH) или экзогенный GSH. Оценивали содержание GSH и ФХ, а также роль GSH в устойчивости к Cu и ее детоксикации. Также мы предоставляем информацию о влиянии Cu, БСО и экзогенного GSH на рост растений и анатомическую структуру корней и листьев.

МЕТОДИКА

Растительный материал и условия эксперимента. Растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (экотип Colombia) выращивали в течение 7 нед. в горшках с дважды автоклавированным садовым грунтом. Затем растения тщательно промывали и переносили по отдельности в пластиковые контейнеры с 0.5 л питательной среды Хогланда (рН 5.5). После двух дней акклиматизации к питательной среде растения подвергли воздействию Cu (CuSO4 х 5 H2O, "POCh", Польша), БСО ("Sigma", Германия) и GSH (восстановленный глутатион, "Sigma"). Растения анализировали после 7 и 14 дней роста на среде с Cu (5 или 50 мкМ), БСО (5, 50 или 500 мкМ) или GSH (5, 50 или 500 мкМ), добавленными по отдельности или в комбинации -Cu/БСО или Cu/GSH (5/50, 50/50, 50/500, мкМ/мкМ). Проростки выращивали при 23/18°С (день/ночь) с 11-часовым фотопериодом при плотности потока фотосинтетических фотонов 140 мкмоль/(м2 с). Питательную среду меняли каждые 7 дней.

Анализ тиоловых пептидов методом ВЭЖХ. Свежие образцы корней и побегов гомогенизировали в двойном объеме 0.1 М HQ в ступке на льду и центрифугировали при 14 000 об./мин при 4°С. Полученные экстракты разделяли в линейном градиенте плотности ацетонитрила с 0.05% три-фторуксусной кислотой в хроматографе Beckman (модель 126/166, "Fullerton", США) с предколон-кой Supelco (4.6 х 10 мм) и колонкой (4.6 х 250 мм) (наполнитель - Ultrasphere C-18). Тиоловые пеп-

тиды подвергали постколоночной дериватизации с 5,5-дитиолбис-2-нитробензойной кислотой ("Sigma") и определяли при 405 нм в Beckman Detector (модель 1бб). Пики рассчитывали по времени удерживания стандартов; расчет площадей пиков проводили, используя компьютерную программу (Gold Nouveau, "Beckman").

Световая и электронная микроскопия. Aпи-кальные отрезки корней (длиной около 5 мм) и небольшие диски из листьев (4 мм2) помещали в среду фиксации (4% глутаровый альдегид в 0.1 М какодилатном буфере, pH 7.4) на 24 ч. Затем ткани трехкратно отмывали по 1.5 ч в какодилатном буфере с последующей фиксацией в 1% осмиевой кислоте с добавлением Твин-20. После вторичного промывания при тех же условиях образцы обезвоживали в серии растворов спирта и ацетона и заливали в смолу LR White. Полутонкие срезы, полученные с помощью стеклянного ножа, просматривали под световым

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»