ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 3, с. 424-433
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА
ЦЕКРОПИНА Р1
© 2013 г. Н. С. Захарченко*, Я. И. Бурьянов*, А. А. Лебедева*, С. В. Пиголева*, Д. В. Ветошкина**, Е. В. Локтюшов***, М. А. Чепурнова**, В. Д. Креславский****, А. А. Кособрюхов****
*Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл. **Учреждение высшего профессионального образования "Тульский государственный университет", Тула ***Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Московская обл.
****Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии
РАН, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 27.07.2012 г.
Получены и исследованы трансгенные растения рапса масличного (Brassica napus L.) с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1 (сесР1). Агробактериальную трансформацию проводили методом вакуумной инфильтрации семян агробактериями GV3101(pMP90RK), содержавшими бинарный вектор рОЛ482::сесР1. Экспрессия гена сесР1 в канамицин-устойчивых растениях показана вестерн-блот анализом и подтверждена определением антимикробной активности растительных экстрактов. Полученные растения проявляли устойчивость к бактериальным и грибным фитопатогенам Erwinia carotovora и Fusarium sporotrichioides. Проведено сравнительное исследование фотосинтетической активности контрольных и трансгенных растений в условиях биотического стресса при заражении фитопатогеном E. carotovora. Установлено меньшее снижение скорости фотосинтеза у цекропин Р1-экспрессирующих растений в условиях заражения. Показана повышенная устойчивость сесР1-растений к окислительному стрессу, вызванному действием пара-квата. Полученные результаты указывают на возможность включения гена цекропина Р1 в интегральную антистрессовую защитную систему растений.
Ключевые слова: Brassica napus - цекропин P1 — агробактериальная трансформация - фотосинтез — микробные фитопатогены — устойчивость - стрессы
DOI: 10.7868/S0015330313030160
ВВЕДЕНИЕ
Рапс — ценное масличное растение сем. Brassi-caceae. Содержание масла в семенах рапса доходит до 40—50%. Продуктивность рапса может снижаться за счет различных заболеваний, вызываемыми фитопатогенными микроорганизмами: Erwinia carotovora, Sclerotinia sclerotiorum, Verticilli-um и др. Для создания новых коммерческих сортов этой культуры используются многие достиже-
Сокращения: ДЭТК — диэтилдитиокарбамат; ЗФл — замедленная флуоресценция хлорофилла а; НСТ — тетразолий нитросиний; СОД — супероксиддисмутаза; сесР1 — цекропин Р1; Кт — канамицин; прШ — неомицинфосфотрансфе-раза II.
Адрес для корреспонденции: Захарченко Наталья Сергеевна. 142290 Московская обл., Пущино, Проспект Науки, 6. Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Электронная почта: zachar@fibkh.serpukhov.su
ния генетической инженерии. Проводятся работы по улучшению качества и соотношения жирных кислот в масле семян [1], улучшению кормовых качеств семян [2], получению растений, устойчивых к гербицидам и патогенам [3, 4]. Одним из методов повышения устойчивости растений к фитопатогенам может быть трансформация растений генами антимикробных пептидов, обладающих широким спектром бактерицидной и фунгицидной активности [5, 6].
Целью нашей работы было получение и фи-зиолого-биохимическое исследование трансгенных растений рапса, экспрессирующих искусственный ген антимикробного пептида цекропина Р1 для повышения устойчивости растений к микробным фитопатогенам и к некоторым стрессовым факторам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектами исследования служили растения рапса (Brassica napus L.) отечественного сорта Глант, полученные из ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур им. В.С. Пустовойта РАСХН (Краснодар). Семена стерилизовали 1.5 мин в 70% этаноле, затем 2 мин в 20% растворе гипохлорита натрия и промывали 3 раза (по 10 мин) в стерильной дистиллированной воде. Семена проращивали на безгормональной среде Мурасига—Скуга (МС), содержавшей 7 г/л агара, 30 г/л сахарозы (рН 5.8) и стандартный набор солей [7]. Растения культивировали при температуре 22-24°С, 16-часовом дне и освещенности 2 клк. Укорененные растения переносили в теплицу. Для анализов брали полностью развитые листья 4-5 ярусов.
Штаммы бактерий и условия их культивирования. Для трансформации использовали агробак-терии GV3101(pMP90RK), содержавшие вектор pGA482 [8] с искусственным геном антибактериального пептида цекропина Р1 (cecP1) [9] и агро-бактерии с "пустым вектором" GV3101 (pMP90RK, pGA482). Ночную культуру бактерий выращивали в среде LB [10], разводили до оптической плотности 1.0 при 600 нм и использовали для трансформации.
В работе использовали фитопатогенные штаммы: 1) штамм бактерии Erwinia carotovora subsp. carotovora В15, полученный из Horticulture СеПхе (Канада), и 2) штамм гриба Fusarium sporotrichio-ides, полученный из ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур им. В.С. Пустовойта.
Трансформация рапса. Для генетической трансформации использовали агробактерии с "пустым" и рекомбинантным вектором с искусственным геном антибактериального пептида cecP1. Трансформацию растений проводили методом вакуумной агроинфильтрации семян [11]. Стерильные семена погружали в 3 колбы: 1 — с суспензией агробактерий GV3101(pMP90RK), содержавших вектор pGA482-сесР1; 2 — с агробак-териями GV3101(pMP90RK), содержавшими пустой вектор pGA482 и 3 — в жидкую среду LB без аг-робактерий. Колбы с семенами помещали в вакуумный эксикатор на 5 мин при отрицательном давлении —0.8 атм. После этого семена помещали на стерильную фильтровальную бумагу для удаления избытка влаги и переносили на агаризованную среду МС. Через двое суток семена перекладывали на свежую среду МС. Для трансформированных семян среда МС содержала антибиотики для элиминации агробактерий (цефотаксим, 500 мг/л) и селекции трансформантов (канамицин, Km, 50 мг/л).
Выделение ДНК из листьев рапса и ПЦР. Для ПЦР анализа выделяли растительную ДНК из листьев [12], которая впоследствии являлась матрицей
в ПЦР анализах. Для этого были использованы праймеры для гена cecP1: (1) 5'-CGGGATC-CATGGGCTCTTG-3' и (2) 5'-CGAGATCTCTACT-TAGCGCGGC-3'. Реакционная смесь содержала 0.1 мкг геномной ДНК рапса, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 50 мМ KCl, 0.1% Тритон Х-100, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ смеси дНТФ ("USB", США), по 50 пкмолей каждого праймера и 2.5 ед. ДНК по-лимеразы Taq ("Promega", США). Реакцию проводили в объеме 25 мкл при следующих условиях: 94°C - 5 мин; 30 циклов: 94°C - 1 мин, 55°C - 30 с, 72°C — 30 с, затем 72°C — 7 мин на амплификато-ре Gene Amp® PCR System 2400 ("Perkin Elmer", США). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 6% ПААГ в Трис-бо-ратном буфере.
Вестерн-блот анализ. Для определения экспрессии гена сесР1 в трансгенных растениях получали бесклеточные экстракты [13]. Электрофорез проводили в трициновой системе ДСН-ПААГ, белки переносили на нейлоновую мембрану PDVF ("Amersham Pharmacia Bio tech", Великобритания) [14]. Иммуноферментный анализ сесР1 проводили с помощью полученных к этому синтетическому пептиду кроличьих поликлональных антител и антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой хрена. Синтетический сесР1 был получен методом твердофазного синтеза. Проявку мембраны производили с помощью хемилюминесцентной системы ECL ("Pierce", США).
Анализ антимикробной активности растительных экстрактов. Для определения бактерицидного эффекта экстрактов трансгенных растений на клетки фитопатогенных бактерий E. carotovora использовали метод радиальной диффузии [15]. Экстракционный буфер содержал: 10% глицерин, 40 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 100 мМ NH4Cl, 4 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10.0 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 3.0 мг/мл дитиотрейтола, 0.2 мг/мл лейпептина, 0.2 мг/мл ингибитора трипсина; 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [16]. Экстракты, содержавшие около 1 мг общего белка, вносили в лунки диаметром 5 мм и глубиной 10 мм, приготовленные в 1.5% LB-агаре с бактериями (108 клеток/мл). Агаровые блоки инкубировали 8 ч при 4° С для диффузии экстрактов в агар, затем блоки переносили на 25°С и через 2 дня локализовали стерильные зоны вокруг лунок.
Биотесты на изолированных листьях и растениях. Для проверки устойчивости трансгенных растений к фитопатогенам листья инфицировали суспензией бактерий E. carotovom или заражали кусочками мицелия гриба F. sporotrichioides [6]. В качестве контроля использовали растения in vivo трех вариантов: 1 - растения рапса, выращенные из стерильных семян, предварительно культивированные 3 нед. in vitro, 2 - растения рапса, выра-
щенные из стерильных семян, подвергшиеся инфильтрации в среде LB, 3 — растения рапса, выращенные из семян, после трансформации агробактериями GV3101(pMP90RK), содержащие пустой вектор pGA482. Фитопатогенными бактериями (суспензия 103—105 клеток/мл) и грибами инокулировали черешки листьев, помещали их на агаризованную питательную среду МС в чашки Петри, выдерживали их в закрытом состоянии при 24°С и 16-часовом световом дне и через 1-14 суток оценивали степень повреждения. Целые растения заражали уколом иглы, смоченной в суспензии патогенных бактерий, в междоузлия. Для заражения грибным патогеном кусочек агара с мицелием помещали в пазушные почки. В каждом варианте опыта заражали по 4 листа.
Исследование газообмена, транспирации и устьичной проводимости. Измерения СО2-газооб-мена, транспирации и устьичной проводимости осуществляли с помощью переносного инфракрасного газового анализатора LCPro+ фирмы "ADC BioScientific Ltd." (Великобритания), соединенного с листовой камерой, поставляемой одновременно с прибором для определения скорости газообмена отдельных листьев. Площадь рабочей поверхности камеры 6.25 см2. Работу проводили с листьями, взятыми с растений, выращенных в теплице, спустя 24 ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.