МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 1, с. 58-67
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.222:576.32
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УСТОЙЧИВОГО К ВАНКОМИЦИНУ ШТАММА STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS 33 GISK VANR
© 2015 г. Л. И. Кононова1, В. П. Коробов
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Поступила в редакцию 21.01.2014 г.
Изучены физиологические особенности селекционированного штамма Staphylococcus epidermidis 33 GISK Vanr, который характеризуется высоким уровнем резистентности к ванкомици-ну и множественной устойчивостью к различным антибиотикам, пониженной чувствительностью к лизоциму, лизостафину и низкомолекулярному катионному пептиду варнерину. Характерной чертой этого штамма является утолщение клеточной стенки бактерий, приводящее к значительному снижению скорости поступления ванкомицина в клетки из среды культивирования и ограничению доступа антибиотика к мишеням на бактериальной мембране.
Ключевые слова: коагулазонегативные стафилококки, ванкомицин, варнерин.
DOI: 10.7868/S0026365615010061
Коагулазонегативные стафилококки (КНС), являясь частью обычной микробиоты человека и животных, могут служить причиной заболеваний, возникающих при нарушении защитных систем организма хозяина как следствия вирусных инфекций, инфицирования имплантированных медицинских устройств, а также неадекватной антибактериальной терапии. Известно, что стафилококки обладают выраженной способностью к адаптации к антибиотическим соединениям, в частности ванкомицину, при нерациональном использовании этого гликопептидного антибиотика для подавления грамположительной микрофлоры [1]. Быстрое появление штаммов стафилококков, обладающих характерной гетерорезистентностью к этому антибиотику, наблюдается во многих странах [2, 3]. В настоящее время чувствительными к ванкомицину считаются бактерии с минимальной ингибирующей концентрацией МИК < 2 мкг/мл, имеющими средний уровень устойчивости — с МИК 4—8 мкг/мл, и устойчивыми — с МИК > > 16 мкг/мл [4].
Базовый генетический механизм формирования резистентности стафилококков к ванкоми-цину до сих пор не известен. Возможно, он связан с утолщением клеточных стенок бактерий [5—7] и возрастанием количества свободных D-аланил-D-аланин-остатков в составе пептидогликана. Это, по-видимому, способствует значительному неспецифическому связыванию антибиотика, снижая его доступ к истинным мишеням на цито-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kononova_1@iegm.ru).
плазматической мембране и вызывая, тем самым, увеличение резистентности бактерий к ванкомицину [8].
Важно отметить, что клинические штаммы S. aureus и КНС с пониженной чувствительностью к ванкомицину обнаружены у пациентов, при лечении которых использовались как глико-пептидные, так и другие антибиотики [9—13]. В то же время, известны гетерорезистентные к ванкомицину штаммы стафилококков, выделенные задолго до внедрения в практику этого антибиотика [14]. Вероятно, проявление ванкомицинрези-стентности у стафилококков возникает благодаря нескольким метаболическим перестройкам, а генетические нарушения у таких штаммов могут накапливаться в течение продолжительного времени [15]. Существует гипотеза, что изменение физиологии стафилококков в результате накопления мутаций приводит к возникновению ван-комицинрезистентного фенотипа [16]. Действительно, генетический анализ значительного количества штаммов стафилококков с повышенной устойчивостью к ванкомицину выявил нарушение экспрессии большого числа генов. В частности, обнаружено изменение экспрессии генов pbp, кодируюших пенициллинсвязывающие белки, участвующие в формировании клеточной стенки [17], а также генов mut, отвечающих за частоту мутаций [18], гена mprF, кодирующего ли-зил-фосфатидилглицерин-синтазу [19], группы генов gra, ассоциированных с устойчивостью к гликопептидам [20], кодирующих двухкомпо-нентную систему GraRS, контролирующую рабо-
ту большого числа генов, в том числе генов, вовлеченных в синтез клеточной стенки [21], группы генов vra двухкомпонентной сенсорной системы VraRS, участвующей в регуляции различных стадий синтеза пептидогликана [22], локуса agr (accessory gene regulator), ответственного за функционирование системы кворум-сенсинга [23], регулона wal, регулирующего процесс деления клетки [24] и других ключевых генов [20, 25, 26].
Целью настоящего исследования явился анализ изменений физиологических характеристик штамма S. epidermidis 33 GISK в процессе приобретения им устойчивости к ванкомицину для выявления механизмов ее возникновения, а также поиска методов подавления бактерий, резистентных к этому антибиотику.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы штамм S. epidermidis 33 GISK, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) Федерального государственного бюджетного учреждения "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Министерства здравоохранения России, и селекционированный в лаборатории вариант этого штамма S. epidermidis 33 GISK \&nr с высоким уровнем устойчивости к ванкоми-цину, полученный культивированием бактерий на жидкой питательной среде LB [27] с повышающимися концентрациями антибиотика, начиная с 0.5 мкг/мл ванкомицина — величины МИК для этого штамма.
На каждом этапе закрепление признака (по образованию колоний) проводили однократным культивированием бактерий на плотной питательной среде LB с соответствующей концентрацией антибиотика.
Бактерии выращивали на орбитальном шейкере Certomat IS ("Sartorius", Германия) при 150 об./мин и температуре 37°C. За динамикой роста бактериальных культур следили по изменению оптической плотности аликвот при 600 нм на спектрофотометре PD-303 ("APEL", Япония).
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) антибактериальных препаратов ванкомицина ("Sigma", США), цефазолина ("Биосинтез", Россия), линезолида ("Fresenius Kabi Norge AS", Норвегия), даптомицина ("Novartis Pharma AG", Швейцария), кларитромицина ("Abbott France", Франция), хлорамфеникола ("Sigma", США), ци-профлоксацина ("Promed Exports", Индия), ген-тамицина ("KRKA", Словения), рифампицина ("Ферейн", Россия), бацитрацина ("Sigma", США), полимиксина В ("Sigma", США), коли-стина ("Sigma", США), лизоцима ("Sigma", США), лизостафина ("Sigma", США) и низкомолекулярного катионного пептида варнерина
для изучаемых штаммов определяли методом двукратных серийных разведений в 96-луночных полистироловых иммунологических планшетах ("Медполимер", Россия). В лунки, содержащие среду LB, вносили бактерии лог-фазы роста в конечной концентрации 5 х 105 КОЕ/мл. Для характеристики чувствительности штаммов к антибиотикам использовали метод диффузии с дисков ("НИЦФ", Россия) [4]. Изучение сохранности признака устойчивости полученного резистентного штамма к ванкомицину с одновременной оценкой его чувствительности к другим антибактериальным препаратам проводили после 20 последовательных пассажей на жидкой среде LB методом двукратных серийных разведений, а также дискодиффузионным методом [4].
Популяционный анализ бактериальных культур проводили, модифицируя метод [28] нанесением аликвот десятикратных разведений суспензий бактерий на агаризованные среды с различными концентрациями ванкомицина [29]. Для этого выращенные на среде LB в течение 18 ч бактериальные культуры чувствительного и устойчивого к ванкомицину штаммов разводили средой до концентрации бактерий 108 КОЕ/мл и наносили на чашки Петри с питательным LB-агаром, содержащим 0, 1, 2 и 4 мкг/мл ванкомицина, для инокуляции десятикратных разведений культуры бактерий £ epidermidis 33 GISK, и 0, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 и 512 мкг/мл для нанесения разведенных аналогично культур бактерий S. epidermidis 33 GISK Vanr. Инкубирование проводили в течение 4-х сут при 37°C, определяя число резистентных клеток в соответствующих культурах бактерий по количеству выросших колоний.
Для выявления динамики связывания ванко-мицина с бактериальными клетками в культуры чувствительного и устойчивого к ванкомицину штаммов в лог-фазе роста вносили ванкомицин (65 мкг/мл), и продолжали культивирование в течение 72 ч на орбитальном шейкере в указанном выше режиме. Изменение содержания ванкоми-цина в среде определяли в супернатантах проб, полученных после осаждения бактерий (16000 g, 10 мин) из аликвот культуральных жидкостей. После стерилизации супернатантов фильтрованием ("Millipore", США, 0.45 мкм) концентрацию антибиотика в них определяли методом двукратных разведений в микропланшетах, используя в качестве тест-штамма S. epidermidis 33 GISK. Одновременно проводили измерения концентрации ванкомицина в среде роста путем определения оптической плотности супернатантов при 240 нм, используя систему Aktapurifier ("GE Healthcare", Швеция) с колонкой ^RPC C2/C18 ST 4.6/100 и градиентом концентрации 0—70% ацетонитрила ("Криохром", Россия) в 0.1% три-
OD600 4
(а)
lgKOE/мл 10 г
10 15 Время, ч
(б)
20
25
8 -
10 15 Время, ч
20
25
Рис. 1. Характеристика роста S. epidermidis 33 GISK (1) и S. epidermidis 33 GISK Vmr (2): а — изменение оптической плотности культур; б — динамика числа жизнеспособных клеток (КОЕ).
фторуксусной кислоте ('Т1ика", США) со скоростью элюирования 1.2 мл/мин.
Интенсивность связывания генцианвиолета бактериями измеряли путем внесения в клеточные суспензии 0.01% раствора генцианвиолета в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.2. Через 20 мин инкубации с красителем при комнатной температуре бактерии осаждали центрифугированием (16000 g, 10 мин), дважды промывали 0.14 М №С1 и осадки экстрагировали этанолом. После осаждения клеток центрифугированием, как указано выше, интенсивность поглощения спиртовых экстрактов красителя измеряли на спектрофотометре РЭ-303 ("АРЕЕ', Япония) при 570 нм.
Изучение морфологии бактериальных клеток проводили атомно-силовой микроскопией. Бактерии лог-фазы роста в среде ЕВ осаждали центрифугированием (3500 ^ 5 мин), дважды промывали 10 мМ фосфатным буфером, рН 7.2, используя тот же режим центрифугирования, а затем фиксировали 2.5% раствором глутарового альдегида в том же
буфере в течение 1 ч. После промывания и суспен-дирования в том же буфере бактерии нан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.