ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 4, с. 469-473
УДК 582.282.123.2:547
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГРИБОВ РОДА Pénicillium - ПРОДУЦЕНТОВ ЭРГОАЛКАЛОИДОВ И ХИНОЦИТРИНИНОВ
© 2011 г. А. Г. Козловский, В. П. Желифонова, Т. В. Антипова, Н. Ф. Зеленкова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290
e-mail: Kozlovski@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 05.07.2010 г.
Четыре культуры грибов рода Pénicillium, относящихся к различным видам подрода Furcatum Pitt: P. citrinum Thom 1910, P. corylophiium Dierckx 1901, P. fellutanum Biourge 1923 и P. waksmanii Zaleski 1927, продуцировали эргоалкалоиды агроклавин-I, эпоксиагроклавин-I, их N-N-димеры — димер эпоксиагроклавина-I и смешанный димер эпоксиагроклавина-I и агроклавина-I, а также хиноли-новые метаболиты — хиноцитринины А и Б. Изучена физиолого-биохимическая характеристика продуцентов. Определены оптимальные условия биосинтеза компонентов метаболома. Добавка цинка в среду стимулировала биосинтез эргоалкалоидов во всех случаях, продукция же хиноцитри-нинов возрастала только у P. citrinum, а у P. corylophiium, P. fellutanum и P. waksmanii подавлялась. Это свидетельствует о том, что гены путей биосинтеза этих метаболитов находятся у продуцентов в разных кластерах.
Грибы рода Pénicillium представляют интерес как источник метаболического разнообразия из-за их хорошо известной способности к синтезу вторичных метаболитов разнообразной структуры, обладающих широким спектром биологической активности, в том числе алкалоидов, антибиотиков, микотоксинов, им-муномодуляторов, иммунодепрессантов. С древних времен широко используются в медицине представители уникального класса соединений, называемого эргоалкалоидами, традиционным продуцентом которого является спорынья — гриб-паразит Claviceps purpurea [1]. К паразитирующим на травах относятся также многочисленные продуценты эргоалкалои-дов, относящиеся к семейству Clavicipitaceae. К настоящему времени накоплен большой объем экспериментальных данных по продукции эргоалкалои-дов пенициллами в сапрофитных условиях, в том числе на средах определенного состава [2]. Среди этих метаболитов эргоалкалоиды —эпоксиагрокла-вин-I и агроклавин-1 (ЭА), биосинтез которых был установлен ранее в процессе скрининга продуцентов эргоалкалоидов у Р. corylophilum ВКМ F-2156 (Д) и P. fellutanum ВКМ F-1073 (=P. sizovae) [3, 4]. Недавно эти соединения были обнаружены у P. citrinum ВКМ FW-800 и P waksmanii ВКМ FW-2875, выделенных из мерзлых древних отложений [5, 6]. Штамм P. fellutanum продуцировал также N-N-димеры эргоалкалоидов — димер эпоксиагроклавина-I (ДЭЭ) и смешанный димер эпоксиагроклавина-I и агрокла-вина-I (ДЭА) [7, 8]. У штаммов P. citrinum и Р waksmanii была также обнаружена способность синтезировать хинолиновые алкалоиды хиноцитринины А и Б (ХЦ) [9].
Цель работы — изучение компоненты метаболома грибов Р. citrinum, P. corylophilum, P. fellutanum и
P. waksmanii, идентифицировать биологически активные вещества алкалоидной природы, а также исследовать физиолого-биохимические характеристики их роста и развития в связи с биосинтезом вторичных метаболитов.
МЕТОДИКА
Использовали культуры из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ РАН — P citrinum Thom 1910 ВКМ FW-800, Р. corylophilum Dierckx 1901 ВКМ F-2156 (Д), P. fellutanum Biourge 1923 ВКМ F-1073 (=P. sizovae) и P waksmanii Zaleski 1927 ВКМ FW-2875. Грибы культивировали глубинным способом на контрольной среде следующего состава (г/л): маннит — 50.0, янтарная кислота — 5.4, MgSO4 • 7H2O - 0.3, КН2Р04 - 1.0, рН доводили до 5.4 конц. раствором NH40H. Цинк вносили в контрольную среду в виде соли ZnS04 • 7Н20 в концентрации 4.4 мг/л. Грибы выращивали в 150 мл среды в колбах объемом 750 мл при 24 ± 1°С на качалке (200-220 об/мин). Засев среды осуществляли водной суспензией конидий (1-2 х 107 спор/мл) 14-су-точных культур, выращенных на скошеном сусло-агаре. Рост культур оценивали по сухой массе мицелия ежесуточно.
Извлечение метаболитов из фильтрата культу-ральной жидкости, их выделение, очистку и идентификацию проводили по методикам, разработанным ранее [10]. Анализ экстрактов осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках силикагеля (Silica gel 60 F254, "Merck", Германия) в системах: хлороформ-метанол-25%-ный NH40H 90 : 10 : 0.1 (I) и 80 : 20 : 0.2 (II). ЭА обнаружи-
вали по поглощению в УФ-свете и после опрыскивания пластин реактивом Эрлиха. Для детекции N-N-димеров эргоалкалоидов использовали их свечение в УФ-свете при 366 нм и окрашивание после обработки реактивом Драгендорфа. Этот реактив применяли также для визуализации ХЦ. Количественный анализ суммарной смеси эргоалкалоидов (СЭА) и ХЦ проводили по методике [10]. Для количественного определения димеров использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию высокого давления (ВЭЖХ). Работу выполняли на хроматографе с УФ-детектором переменной длины волны и системой обсчета хроматограмм фирмы "LKB-Pribori А" (Швеция). Рабочая длина волны 280 нм, расход подвижной фазы 0.9 мл/мин, объем пробы 20 мкл. Подвижная фаза состояла из метанола, воды и 25%-но-го водного раствора аммиака в соотношении 78 : 22: 0.0036 (об. %), температура анализа 30°С. Разделение выполняли на колонке, заполненной обращенно-фазовым сорбентом Nova-Pak С 18, 150 х х 3.9 мм, ("Waters", США). Общая продолжительность анализа составляла 20 мин. Времена удерживания ДЭЭ и ДЭА составляли 6.20 и 16.04 мин соответственно. Идентификацию соединений проводили, сопоставляя параметры удерживания стандартов и анализируемых соединений. Количественное определение выполняли методом абсолютной градуировки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация метаболитов. В "кислых" экстрактах культуральной жидкости P. corylophilum и P.fellutanum методом ТСХ на пластинах силикагеля были обнаружены два метаболита с Rf 0.14 и 0.12 (I); 0.67 и 0.62 (II), дающие ярко оранжевую окраску с реактивом Драгендорфа (азотсодержащие соединения), но реактив Эрлиха — реагент на индольные соединения, давал отрицательный результат. Оба метаболита имели одинаковую хроматографическую подвижность в системах растворителей (I) и (II) со стандартными образцами хинолиновых алкалоидов — ХЦ А и Б соответственно. УФ-спектры образцов метаболитов были идентичны и совпадали со спектрами ХЦ (^макс, метанол: 216, 248, 256, 300, 314, 328 нм) [9]. На основании этих данных нами был сделан вывод о том, что соединения, выделенные из "кислых" экстрактов P. corylophilum и P. fellutanum являются хинолиновыми алкалоидами — ХЦ А и Б.
На хроматограммах "щелочных" экстрактов культуральной жидкости штаммов P citrinum, P. corylophilum и P. waksmanii помимо основных метаболитов ЭА было обнаружено вещество с Rf 0.35 (I) и 0.75 (II), дающее положительную реакцию с реактивом Драгендорфа, но не окрашиваемые с реактивом Эрлиха. У штаммов P. citrinum, P. corylophilum был также обнаружен второй метаболит с аналогичными характеристиками, но отличающийся по хроматогра-фической подвижности с Rf 0.30 (I) и 0.74 (II). Выделенные соединения флуоресцировали под УФ-све-
том при 366 нм. УФ-спектры метаболитов были практически идентичны и содержали полосы поглощения, соответствующие замещенному индольному хромофору при 271, 284 и 292 нм, причем максимально интенсивное поглощение наблюдалось при 271 нм, что характерно для М-М-димеров эргоалкалоидов, таких, как ДЭЭ и смешанный ДЭА [7, 8]. Данные ВЭЖХ по хроматографической подвижности и параметрам удерживания исследованных метаболитов и стандартных образцов ДЭЭ и ДЭА также свидетельствовали об их идентичности. Времена удерживания для первого метаболита и для ДЭЭ равны 6.20 мин. Форма размывания пика второго метаболита и время удерживания (16.04 мин) совпали с соответствующими характеристиками для стандартного образца ДЭА. На основании приведенных выше данных, в том числе и по отсутствию реакции с реактивом Эрлиха, специфической для N-N-,0^-меров эргоалкалоидов, можно сделать вывод, что выделенные метаболиты представляют собой соответствующие М-М-димеры эргоалкалоидов — ДЭЭ и ДЭА, ранее обнаруженные у P. fellutanum ВКМ Б-1073 [7, 8].
Физиолого-биохимические характеристики продуцентов. Культуры, синтезирующие эргоалкалоиды и ХЦ, были выделены в разных географических регионах из почвенных образцов различного геологического возраста. Представителями современной мик-робиоты являются Р. corylophilum и P.fellutanum [3, 4], а древней, датируемой 100—200 тыс. лет и 1.8—3 млн. лет, Р. waкsmaniiи Р. citrinum соответственно [5, 6]. Логично предположить, что функционирование путей биосинтеза этих вторичных метаболитов обеспечило выживание культур в условиях изменения местообитаний под влиянием внешних факторов в течение значительного времени даже в масштабах эволюции. Гены или кластеры генов путей биосинтеза не перешли в разряд "спящих" или "молчащих", а экспрессируют-ся в довольно широком интервале условий культивирования [11]. Это фактически означает, что ферменты, осуществляющие реакции биосинтеза этих компонентов метаболома, являются конститутивными.
Изученные культуры-продуценты отличались по интенсивности продукции алкалоидов. Наибольшие показатели биосинтеза СЭА и ХЦ в контрольной среде наблюдались у P. waksmanii, а у других были значительно ниже (табл. 1). Низкое накопление биомассы (4—8 г/л) и раннее конидиообразование при росте культур на контрольной среде, содержащей большое количество источников углерода, азота и макроэлементов, свидетельствует о недостатке в среде других компонентов, например микроэлементов. Ранее было показано, что только внесение в среду культивирования цинка приводило к стимулированию биосинтеза алкалоидов P. citrinum [9]. Внесение этого микроэлемента в среду культивирования для других продуцентов приводило к усилению ростовых процессов и биосинтеза эргоалкалоидов этими культурами (табл. 1). При этом у исследу-
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГРИБОВ 471
Таблица 1. Влияние ионов цинка на максимальные показатели роста и биосинтеза алкалоидов изученными продуцентами
Продуцент Наличие
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.