ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 3, с. 318-323
УДК 581.1
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЦИАНОБАКТЕРИИ Oscillatoria deflexa
© 2009 г. И. В. Грибовская, Г. С. Калачёва, Ю. И. Баянова, Ä. Ä. Колмакова
Институт биофизики СО РАН, Красноярск 660036; e-mail: gribov@ibp.ru Поступила в редакцию 12.12.2007 г.
Исследованы оптимальные условия культивирования цианобактерии Oscillatoria deflexa: температура (25-27°С), рН (9.0-11.0), освещенность 7 клк. Подобрана питательная среда, обеспечивающая оптимальный рост цианобактерии и испытаны среды с использованием водной вытяжки золы урины человека и непищевых отходов пшеницы и овощей с добавками нитратов и бикарбонатов. Впервые исследован химический состав O. deflexa: макро-, микроэлементы и содержание белков, липидов, углеводов, витаминов, аминокислотный и жирнокислотный составы, зольный остаток. Анализ результатов свидетельствует, что O. deflexa не уступает используемым в практических целях цианобактерии Spirulina platensis и зеленой водоросли Chlorella vulgaris по минеральному составу, содержанию витаминов, и незаменимых аминокислот и жирных кислот, и превосходит их по содержанию витамина Е и микроэлементов - Fe, Mn, Ni. Исследована способность бактерий переносить NaCl до 30 г/л в среде, а также показана их уникальная способность к выживанию и длительному хранению. Показанно ингибирующее воздействие биомассы O. deflexa на прорастание зерен пшеницы и рост дафний и коловраток.
Род Oscillatoria из отдела синезеленых водорослей довольно близок роду Spirulina (Arthrospira) [1], представитель которого Spirulina platens, как и зеленая водоросль Chlorella vulgaris, имеет широкое практическое использование. В последнее время им найденно применение в медицине, парфюмерии, как пищевые добавки для человека и животных [2], а также в системах жизнеобеспечения в качестве фотосинтезирующих низших организмов [3, 4]. Си-незеленая водоросль Oscillatoria deflexa впервые была обнаружена в Антарктике [5], встречается в соленых озерах. Она имеет нитчатое строение и для нее характерно соединение трихомов в спирально завернутые пучки. Сведения о ее физиолого-биохи-мических свойствах в литературе крайне ограничены, нами не найдены данные о выращивании этого организма в лабораторной культуре. Известно, что представители рода Oscillatoria в составе клеток содержат более 60% белков, 20% углеводов и около 6% жиров, что сопоставимо с данными для зеленых водорослей, но отличаются от них высокой зольностью [6]. Эта группа микроорганизмов достаточно вариабельна по составу жирных кислот, некоторые из них могут синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, основными из которых являются а-линоленовая или у-линоленовая кислоты [7, 8]. Однако для других представителей рода Oscillatoria характерно отсутствие полиненасыщенных кислот [7] или крайне низкое их содержание [9].
O. deflexa представляет интерес, как фотосинте-зирующая цианобактерия, близкая по продуктивности S. platensis, но с более высокими адаптационными свойствами и большей экономничностью по за-
тратам энергии на культивирование (температура, освещенность). Известно, что Oscillatoria brevis может расти в присутствии тяжелых металлов и обладает эффективным катион-транспортным каналом СРх-АТФазы [10], что предполагает подобный механизм у исследуемой цианобактерии.
Цель работы - подбор оптимальных условий для выращивания O. deflexa в культуре, исследование устойчивости к засолению NaCl, культивирование на окисленных отходах человека и растений, исследование токсичности, способности к хранению и выживанию, а также анализ биохимического состава в сравнении с другими водорослями, нашедшими широкое практическое применение.
МЕТОДИКА
O. deflexa выращивали в периодическом режиме с барбатажем воздуха и без него в лабораторном люминостате при разной освещенности, температуре, рН и минеральном составе питательной среды. О продуктивности культуры судили по весу сухой промытой биомассы в стационарной фазе роста (на 8-9 сут культивирования). Для биохимического анализа использовали промытую сухую биомассу. Для этого культуру центрифугировали (15 мин, 4000 g). Клетки промывали центрифугированием с дистил-лированой водой. Содержание калия и натрия определяли на пламенном фотометре Flapho-4 ("Carl Zeiss", Германия), а кальция и магния - методом атомной абсорбции на спектрофотометре AAS-1N ("Carl Zeiss", Германия). Фосфор определяли фотометрически, используя фотоколориметр КФК-2
(ЛОМО, Россия), серу - объемным методом с индикатором нитхромазо [11]. Липиды экстрагировали из свежесобранной биомассы смесью изопропанол-хлороформ в отношении 1 : 1 по объему. Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров на газовом хроматографе с масс-спектрометриче-ским детектором ("Hewlett Packard", США) [12]. Углеводы определяли антроновым методом, белок -по Лоури. При определении аминокислотного состава O. deflexa 50 мг образца помещали в стеклянную ампулу, заливали 20 мл 6 н. HCl и запаивали, гидролиз проводили в течение 22 ч в термостате при 110°С. После охлаждения и фильтрации содержимое ампулы помещали в колбу и выпаривали на водяной бане. Осадок растворяли в цитратном буфере, рН 2.2. Состав аминокислот анализировали на аминокислотном анализаторе KLA-3B ("Hitachi", Япония) [13]. Витамины определяли общепринятыми методами [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Поскольку род цианобактерий Oscillatoria близок по свойствам и морфологии роду Spirulina, то следовало предположить, что и расти они в культуре будут на подобных по минеральному составу питательных средах. Для культивирования S. platen-sis обычно используют щелочную (рН10.0) модифицированную среду Зарроука [15], в которую входит бикарбонат натрия (16.8 г/л). Эта среда, как и ожидалось, не лимитировала рост O. deflexa, поэтому в дальнейшем служила контролем. O. deflexa выращивали при естественном освещении, но люминесцентное освещение увеличивало скорость роста. Рост культуры тормозил свет от ламп накаливания. Выращивали O. deflexa в люминостате в периодическом режиме в стеклянных конических колбах с барбатажем и без барбатажа, но с периодическим помешиванием. Оптимальным для роста культуры было круглосуточное освещение 67 клк (3-3.5 клк сверху и 3-3.5 клк снизу). При освещении выше 7 клк культура изменяла цвет с сине-зеленого на бурый и снижала продуктивность. Исследования показали, что O. deflexa могла расти в широком диапазоне температур, но оптимальной для роста была температура 2б-27°С, выше которой культура меняла цвет и резко замедляла рост.
При определении оптимальных значений рН для роста O. deflexa ее засевали в колбы со средой Зарроука, в которых предварительно устанавливали рН от 5.0 до 9.0 с помощью HCl, а от 10.0 до14.0 -щелочью. Оказалось, что исследуемая цианобакте-рия может существовать в широком диапазоне рН от 6.0 до 12.0, с оптимумом рН 9.0-10.0. При культивировании O. deflexa по сравнению с S. platensis и C. vulgaris было затрачено меньше энергии на выращивание. Так, оптимальная температура для культивирования S. platensis - 32-35°С, освещен-
Таблица 1. Накопление натрия и продуктивность Oscilla-toria deflexa на фоне возрастающих концентраций NaCl в среде (% на сухое вещество)
NaCl, г/л Биомасса Na, г/л Биомасса, г/л
10 Непромытая 14.2 ± 0.7 -
Промытая 2.7 ± 0.3 2.3 ± 0.3
20 Непромытая 15.5 ± 0.6 -
Промытая 2.5 ± 0.3 2.0 ± 0.2
30 Непромытая 15.6 ± 0.8 -
Промытая 3.1 ± 0.4 1.7 ± 0.3
1(контроль) Непромытая 10.6 ± 0.5 -
Промытая 2.4 ± 0.3 2.0 ± 0.4
Примечание. "-" - не определяли.
ность - 10-11клк [16, 17], у C. vulgaris - 35-38°С и 16 клк соответственно [16], в то время как у O. deflexa - 26-27°С и 6-7 клк соответственно. Оптимальное значение выращивания S. platensis было таким же, как у O. deflexa, в то время как C. vulgaris могла расти только в нейтральной среде (рН 6.0-7.0) и гибла в кислой и щелочной.
При благоприятных условиях освещения, температуре и рН на среде Зарроука в накопительном режиме при периодическом перемешивании культура O. deflexa через 8-9 сут вступала в стационарную фазу роста с максимальной продуктивностью 2.0 г сухой биомассы/л, что не отличалось от ранее полученных нами данным для S. platensis [17]. В режиме роста с барбатажем воздуха продуктивность культуры увеличивалась до 2.5 г сухой биомассы/л.
Известно, что S. platensis может расти в засоленных средах с концентрацией NaCl 30 г/л [18], что немаловажно для систем жизнеобеспечения, где и возможно накопление солей натрия в случае замкнутого массообмена. В исследованиях, подобных опытам со S. platensis, была проверена устойчивость O. deflexa к засолению. Контролем служила культура, выращенная на модифицированной среде Зарроука, с концентрацией NaCl 1 г/л. В опыте содержание NaCl в среде Зарроука было доведено до 10, 20 и 30 г/л. Можно сделать вывод (табл. 1), что O. deflexa устойчива к засолению. Угнетение роста на 15% по сравнению с контролем наступало только при концентрации NaCl 30 г/л. При 10 г/л биомасса превосходила контрольную на 10%. O. deflexa обладала способностью расти в условиях повышенной солености среды, как и S. platensis [18]. Повышение концентрации NaCl в растворе не вызывало существенного накопления соли в клетках O. deflexa. В промытой биомассе при засолении NaCl 30 г/л по сравнению с контролем содержание натрия возросло с 2.4 до 3.1% , в непромытой биомассе - с 10.6 до 15.6%. Следовательно, O. deflexa имеет устойчивый мембранный барьер по отношению к натрию.
Таблица 2. Минеральный состав O. deflexa, S. platensis и C. vulgaris [16] (% на сухое вещество промытой биомассы)
Вид K, % Na, % Ca, % Mg, % P, % S, % Fe, мг % Mn, мг % Zn, мг % Cu, мг % Ni, мг % Cr, мг % Pb, мг % Mo, мг % Зола, %
S. plat- 1.63 ± 1.30 ± 0.12 ± 0.43 ± 1.1 ± 0.6 ± 90.0 ± 8.0 ± 3.7 ± 0.48 ± 0.47 ± 0.47 ± 0.13 ± 0.06 ± 7.1 ±
ensis ± 0.20 ± 0.30 ± 0.03 ± 0.07 ± 0.08 ± 0.07 ± 8.0 ± 0.9 ± 0.4 ± 0.07 ± 0.09 ± 0.07 ± 0.02 ± 0.01 ± 0.85
C. vul- 1.38 ± 0.11 ± 0.13 ± 0.59 ± 1.43 ± 0.60 ± 65.2 ± 2.1 ± 5.2 ± 2.5 ± 0.14 ± 0.18 ± 0.22 ± 1.24 ± 4.0 ±
garis ± 0.22 ± 0.01 ± 0.02 ± 0.08 ± 0.10 ± 0.06 ± 5.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.