ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 2, с. 158-168
УДК 541.118+577.152.1
ФЛАВОНОИДЫ - ЭФФЕКТИВНЫЕ ПРОТЕКТОРЫ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ОТ ИНАКТИВАЦИИ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ КАВИТАЦИЕЙ
© 2007 г. Е. И. Карасёва*, В. П. Курченко**, Д. И. Метелица*
*Институт биоорганической химии НАН Белоруссии, Минск, 220141; e-mail: metelitza@iboch-bas.net.by **Белорусский государственный университет, Биологический факультет, Минск, 220064;
e-mail: kurchenko@tut.by Поступила в редакцию 4.05.2005 г.
Инактивацию глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФДГ) при 44°С и воздействии низкочастотного ультразвука (27 кГц, 60 Вт/см2) в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, снижали семь флавоноидов разной структуры. Проведено сравнительное изучение влияния флавоноидов на эффективные константы скорости первого порядка, характеризующие суммарную (термическую и ультразвуковую)
инактивацию - 1син, термическую k* и ультразвуковую ^н(уз) инактивацию Г6ФДГ в концентрации 2.5 нМ. Получены зависимости этих констант скорости инактивации Г6ФДГ от концентрации флавоноидов (0.01-50 мкМ). По эффективности протекторного действия на Г6ФДГ использованные флавоноиды располагались в следующий ряд: гесперидин > морин > силибин > нарингин = кверце-тин > кэмпферол §> астрагалин. Полученные данные подтверждают важную роль свободных радикалов Н O и O2 , образующихся в поле УЗ-кавитации, в инактивации Г6ФДГ в растворе.
Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) содержится во всех клетках организма человека и животных и играет ключевую роль в пентозофосфатном цикле, так как поставляет восстановленный НАДФН для синтеза жирных кислот [1]. Г6ФДГ часто применяется в иммуно-биотехнологии в качестве маркера антигенов в гомогенном иммуноферментном анализе [2, 3]. Г6ФДГ из разных природных источников, как правило, димерный белок, что отражается на ее термической и УЗ-устойчивости [4, 5]. Термоинактивация Г6ФДГ и ее коньюгатов со стероидами детально изучена ранее в нашей лаборатории [6-12].
Потребности биотехнологии вызвали необходимость изучения инактивации Г6ФДГ в водных растворах при воздействии кавитации, создаваемой НЧ-УЗ (27 кГц, исходная удельная мощность
Сокращения: ГБ - 0.1 М №ОН-глициновый буфер, Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, ГФ - глюкозо-6-фосфат, НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфос-фат окисленный, ВЧ-УЗ - высокая частота ультразвука, НЧ-УЗ - низкая частота ультразвука, УЗ - ультразвук, ФБ - 0.1 М фосфатный буфер, кин - суммарная (общая) эффективная константа скорости инактивации первого порядка, мин-1, к*н - эффективная константа скорости
термоинактивации фермента, мин-1, кин(уз) - эффективная константа скорости ультразвуковой инактивации фермента, мин-1.
60 Вт/см2) и ВЧ-УЗ (880 кГц, 1 Вт/см2) [4, 5]. Выбор этих частот УЗ обусловлен широким применением НЧ-УЗ (20-27 кГц) для реканализации сосудов при остром тромбозе периферических артерий и глубоком тромбозе вен [13] и ВЧ-УЗ при диагностике и лечении болезней опорно-двигательного аппарата и многих других патологиях. Нами показано, что в процессе УЗ-инактивации Г6ФДГ в растворах большую роль играют кислородсодержащие активные радикалы Н О и Н 02, образующиеся в поле ультразвуковой кавитации, создаваемом НЧ-УЗ и ВЧ-УЗ, так как ловушки
радикалов Н О (диметилформамид, этанол, бу-танол, маннит и др.) существенно снижали скорость УЗ-инактивации фермента [5].
Хорошо известно, что многие природные флавоноиды обладают антиоксидантными свойствами и часто используются для ингибирования свобод-норадикальных радиационных и биохимических реакций. В большой степени антиоксидантная активность флавоноидов определяет их выраженные антиаллергические, антиканцерогенные, антимутагенные, противовоспалительные и противовирусные свойства [14]. Недавно в нашей лаборатории показано, что растительный флавоноид астрагалин, выделенный из наземной части папоротника-голокучника трехраздельного (Gymnocarpium dry-opteris), с высокой эффективностью предохраняет
субъединичный фермент - каталазу печени быка (КФ 1.11.1.6) от инактивации в растворах, вызванной НЧ-УЗ (27 кГц) высокой мощности 60 Вт/см2 [15]: флавоноловый гликозид астрагалин по эффективности протекторного действия на каталазу превосходит такие известные синтетические анти-оксиданты, как пропилгаллат и 4-трет-бутил-пи-рокатехин.
Практические аспекты воздействия УЗ на Г6ФДГ очевидны и связаны с ее применением в иммунобиотехнологии (иммуноферментный анализ, биосенсоры, акустометрический анализ), где часть процессов сопровождается озвучиванием и/или объектов анализа, что вызывает необходимость использования протекторов фермента от его инактивации ультразвуком.
Цель работы - систематическое кинетическое изучение влияния природных флавоноидов на инактивацию Г6ФДГ в растворах, инициированную воздействием низкочастотного ультразвука (27 кГц) высокой исходной мощности (60 Вт/см2), для выбора наиболее эффективных протекторов фермента из семи растительных флавоноидов, структура которых представлена на рис. 1.
МЕТОДИКА
Реагенты. Использовали Г6ФДГ из Leuconos-toc sp. 5s производства НПО "Фермент" (Вильнюс, Литва) с удельной активностью 465 ед./мг белка при 30°С и рН 7.8. Для определения концентрации фермента использовали коэффициент
его поглощения D|°%°м (280 нм) = 11.5 [12]. Применяли глицин, ГФ и НАДФ фирмы "Reanal" (Венгрия). Все остальные реагенты были производства "Реахим" (Россия) квалификации х.ч. Диметил-формамид (ДМФ) и этанол перед употреблением перегоняли.
Флавоноиды. Флавоноловый гликозид астрагалин выделен из надземной части папоротника-голокучника Gymnocarpium dryopteris L. и охарактеризован, как описано ранее [16]. Астрагалин имел мол. массу 416 Да и был любезно предоставлен нам доктором хим. наук Н.В. Ковганко (ИБОХ НАН Беларуси).
Кэмпферол (286 Да) получен кислотным гидролизом астрагалина. Кверцетин (302 Да), морин в виде дигидрата (338 Да), силибин (482 Да) получены у фирмы "Sigma" (США). Флавоноловые гликозиды нарингин (580.55 Да) и гесперидин (610.57 Да) приобретены у фирм "Fluka" (Швейцария) и "Sigma" (США) соответственно. Все флавоноиды использованы без дополнительной очистки.
Исходные растворы гесперидина готовили в смеси ДМФ-этанол (4:1), а растворы всех остальных флавоноидов - в свежеперегнанном ДМФ.
Ультразвуковая обработка растворов Г6ФДГ.
Для обработки растворов фермента применяли УЗ-генератор "Техносоник" (МВТУ им. Н.Э. Баумана, Москва), снабженный пьезокерамическим преобразователем и титановым волноводом с рабочей частотой 27 кГц и исходной удельной мощностью 60 Вт/см2, что соответствовало амплитуде колебаний торца волновода 57 мкм. Озвучивание растворов Г6ФДГ (конечная концентрация всегда равнялась 2.5 нМ) в 0.1 М ФБ, рН 7.4 проводили в непрерывном режиме в стеклянном стакане высотой 7.5 см с диаметром 3.2 см, погружая волновод в 30 мл раствора (высота 3.5 см) таким образом, что расстояние торца волновода от дна сосуда составляло 1.5 см. Стакан с раствором термостатировали и проводили озвучивание при температуре 44°С.
Растворы для озвучивания готовили следующим образом: к 32.8 мл 0.1 М ФБ, рН 7.4, добавляли 0.1 мл исходного раствора соответствующего флавоноида необходимой концентрации и 0.1 мл 0.825 мкМ раствора Г6ФДГ в дистиллированной воде. Из полученной смеси общим объемом 33 мл отбирали 3 мл для изучения термоинактивации фермента при 44°С. Растворы обработанной УЗ Г6ФДГ были насыщены воздухом, что обеспечивало практически постоянную концентрацию О2, равную ~10-4 М по данным работы [17]. В ходе термоинактивации и при обработке раствора Г6ФДГ УЗ до 82 мин температура растворов повышалась не более, чем на 1°С. По ходу термоинактивации и при обработке УЗ раствора Г6ФДГ отбирали аликвоты для определения начальной (D0) и остаточной (D) активности Г6ФДГ при той же температуре (44°С), при которой обрабатывали раствор термически или ультразвуком.
Определение начальной и остаточной активности Г6ФДГ. Для определения D0 и D в ходе инактивации фермента готовили реакционную смесь общим объемом 1 мл, содержавшую 0.55 мл 0.143 М №ОН-глицинового буфера, рН 9.6, 0.1 мл раствора ГФ (0.04 М) и 0.05 мл НАДФ (0.01 М) в том же буфере, 0.3 мл Г6ФДГ (2.5 нМ) в ФБ, рН 7.4. Перед добавлением фермента смесь выдерживали 3 мин при 44°С. Начальное рН буфера 9.6 (при 20°С) снижалось до оптимальной величины рН 9.1 при 44°С. Конечные концентрации реагентов в 0.1 М №ОН-глициновом буфере, рН 9.1 составляли 0.75 нМ Г6ФДГ, 4.0 мМ ГФ, 0.5 мМ НАДФ.
Все спектрофотометрические измерения проводили на приборе Specol-211 ("Carl Zeiss", Германия) с термостатируемым кюветным отделением. Первый отсчет начинали через 10 сек после введения в раствор аликвоты исходной или частично инактивированной Г6ФДГ, и вели реакцию 1 мин, регистрируя поглощение НАДФН при 340 нм. Начальные скорости реакции определяли по начальным линейным участкам роста оптической
ОН
ОН
I Л; с 2
5 4 °Н
НО
ОН
ОН О
ОН О
1 НО
НО
ОН
а ,ОН2°Н
НО
ОН О
3
ОН О
ОН
НО
ОН
ОН ОН
ООНз ОН
ОН
НО
ОН
ОН
7
ООНз
ОН
ОН
ОН ОН
ОН
6
ОН О
Рис. 1. Структурные формулы флавоноидов, использованных в работе: 1 - кверцетин, 2 - кэмпферол, 3 - морин, 4 -силибин, 5 - нарингин, 6 - гесперидин, 7 - астрагалин.
плотности и вычисляли относительные величины В/В0 в процентах.
Количественная характеристика Г6ФДГ при УЗ-обработке в водных растворах. Суммарную (температурную и ультразвуковую) инактивацию Г6ФДГ характеризовали эффективной константой скорости первого порядка кин в мин1, кото-
рую определяли из полулогарифмических анаморфоз зависимостей В/В0 от времени обработки УЗ растворов при 44°С. Термическую инактивацию Г6ФДГ характеризовали эффективными
константами скорости первого порядка к*н в
мин-1, которые определяли из полулогарифмиче-
5
1п D/Dl 0
-0.1
-0.2 -0.3 -0.4 -0.5 -0.6
20
40
60
80 мин
кин 103, мин 1 8
7
6
5
4
3
2
1
0
-6 -5
^ [кэмпферол]
Рис. 2. Полулогарифмические анаморфозы кинетических кривых инактивации Г6ФДГ (а) и зависимости констант скорости инактивации от концентрации кэмпферола (б) при 44°С и обработке растворов Г6ФДГ НЧ-УЗ. а: 1 - 0, 2 -0.01, 3 - 0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.