= МОЛЕКУЛЯРНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 577.2:611.018.53:539.1.047
ФОНОВОЕ КОЛИЧЕСТВО ФОКУСОВ yH2AX В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА КАК ФАКТОР ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
© 2015 г. С. А. Васильев1, 2, *, А. И. Величевская2, Т. В. Вишневская2, А. А. Беленко2, О. В. Грибова3, М. Б. Плаксин4, Ж. А. Старцева3, И. Н. Лебедев1, 2
1НИИмедицинской генетики, Томск 2Томский государственный университет, Томск 3Томский НИИ онкологии, Томск 4Клиническая больница № 81ФМБА России, Северск
Фоновый уровень повреждений ДНК и радиочувствительность клеток человека характеризуются значительной межиндивидуальной вариабельностью. Фосфорилирование гистона H2AX (yH2AX) в клетках приводит к включению сигнальной системы, направленной на репарацию двунитевых разрывов ДНК, запуск клеточного старения и активацию контрольных точек клеточного цикла. При этом остается неясной природа фоновых фокусов yH2AX и их влияния на клеточную радиочувствительность и эффективность восстановления радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках человека. В работе у 54 здоровых индивидов проведен анализ связи фонового количества фокусов yH2AX в лимфоцитах периферической крови с частотой индуцированных in vitro (2 Гр) цен-тромеро-негативных и центромеро-позитивных микроядер. Обнаружена обратная корреляция между спонтанным количеством фокусов yH2AX и уровнем центромеро-негативных микроядер после облучения. Соответствующие корреляции между спонтанным количеством фокусов белка 53BP1 и частотами центромеро-негативных микроядер оказались статистически незначимыми. Кроме того, клетки индивидов с высокой частотой радиационно-индуцированных микроядер характеризовались также низкой пролиферативной активностью. Эндогенные фокусы yH2AX представляют собой собранные комплексы, состоящие из белков репарации двунитевых разрывов ДНК и сигнальных медиаторов, участвующих в активации компонентов контрольных точек клеточного цикла. По-видимому, у индивидов с низким спонтанным количеством фокусов yH2AX система репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК работает менее эффективно и большее число двунитевых разрывов ДНК после воздействия ионизирующего излучения остается нерепарированным. Это приводит как к нарушению клеточного деления в части клеток, так и к потере фрагментов хромосом в виде центромеро-негативных микроядер в ходе митоза в клетках, завершивших деление.
Двунитевые разрывы ДНК, репарация ДНК, фокусы yH2AX, микроядра, лимфоциты периферической крови человека, индивидуальная радиочувствительность, FISH.
DOI: 10.7868/S0869803115040128
Фоновый уровень повреждений ДНК в клетках человека характеризуется значительной вариабельностью. В основе таких межиндивидуальных различий лежат, с одной стороны, генетические причины, такие как мутации и полиморфизмы генов репарации ДНК, детокси-кации ксенобиотиков, антиоксидантной защиты [1]. С другой стороны, фоновое количество повреждений ДНК определяется уровнем мутагенной нагрузки, которой подвергаются клетки человека.
* Адресат для корреспонденции: 634050 Томск, ул. Набережная р. Ушайки, 10, НИИ медицинской генетики; тел.: (3822) 51-31-46; факс: (3822) 51-37-44; e-mail: stanislav.vasi-lyev@medgenetics.ru.
В ответ на индукцию двунитевых разрывов ДНК в результате воздействия ионизирующего излучения и других мутагенов, включая продукты окислительного стресса, в клетках включаются сигнальные системы, направленные на репарацию повреждений ДНК и активацию контрольных точек клеточного цикла. Недавно была предложена новая чувствительная методика определения числа двунитевых разрывов ДНК, основанная на анализе белков, участвующих в репарации этих разрывов. В клетке в ходе ответа на действие ионизирующего излучения наблюдается образование так называемых радиационно-инду-цированных фокусов белков репарации ДНК [2]. Они являются динамическими структурами, содержащими тысячи копий белков, участвующих в
различных этапах репарации двунитевых разрывов ДНК и передаче сигналов. Эти структуры могут оцениваться микроскопически в виде дискретных фокусов, окружающих двунитевые разрывы ДНК. Среди белков, участвующих в образовании радиационно-индуцированных фокусов, особое значение придается фосфорилиро-ванному гистону H2AX (yH2AX) [3]. Так как число радиационно-индуцированных фокусов yH2AX тесно связано с количеством двунитевых разрывов, принято считать, что фокусы yH2AX локализуются в местах двунитевых разрывов ДНК [4].
Образование в клетках фокусов белков репарации ДНК приводит к включению сигнальной системы, направленной на запуск клеточного старения [5], активацию контрольных точек клеточного цикла [6] и репарацию повреждений ДНК. Однако остается неясной степень сопряженности количества фоновых фокусов белков репарации ДНК с клеточной радиочувствительностью и эффективностью восстановления радиационно-ин-дуцированных повреждений в клетках человека. Поэтому цель настоящей работы заключалась в анализе связи фонового количества фокусов белков репарации ДНК с индивидуальной радиочувствительностью клеток человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для достижения цели исследования использовались лимфоциты периферической крови 54 жителей г. Томска и г. Северска мужского пола, не связанных в ходе профессиональной деятельности с действием радиации. Средний возраст обследованных лиц составлял 37.6 ± 13.1 лет (24— 72 года). От каждого индивида было получено письменное согласие на проведение исследования и собраны анкетные данные.
От каждого индивида на базе клиники НИИ медицинской генетики (г. Томск) был произведен забор 18 мл крови в вакуумные пробирки, покрытые натриевой солью гепарина (Vacuette, "Greiner", Германия). Кровь в одной из пробирок подвергали воздействию у-излучения 60Co в дозе 2 Гр, другой образец от того же индивида являлся контрольным. Облучение производили с помощью гамма-терапевтического аппарата "Theratron Equinox" ("Best Theratronics", Канада) на базе Томского НИИ онкологии (мощность дозы — 0.67 Гр/мин). В необлученных лимфоцитах периферической крови каждого донора анализировали количество фокусов белков yH2AX и 53BP1 и частоту микроядер, тогда как в облученных клетках проводилась оценка только частоты микроядер.
Анализ фокусов белков yH2AXи 53BP1. Лимфоциты из периферической крови выделяли с помо-
щью центрифугирования в градиенте фиколл-ве-рографина (р = 1.077) ("ПанЭко", Россия). После выделения клетки наносили на предметные стекла, покрытые полилизином для улучшения адгезии ("Menzel", Германия). Препараты накрывали покровным стеклом и оставляли на 10 мин, после чего покровное стекло удаляли и препараты фиксировали в 3%-ном растворе парафор-мальдегида в течение 20 мин при 4°С. После дальнейшей отмывки в фосфатном буфере (PBS) проводили пермеабилизацию в 0.2%-ном растворе Triton X-100 ("Sigma", США) в течение 10 мин при 4°С. Затем препараты отмывали в трех сменах PBS по 5 мин и помещали в 3%-ный раствор FBS на 30 мин при 4°С.
Для иммуноокрашивания были использованы следующие первичные антитела: моноклональ-ные мышиные антитела к белку yH2AX ("Novus", Канада) и поликлональные антитела кролика к белку 53BP1 ("Novus", Канада). Вторичными антителами, несущими флуорохромы, были мышиные антитела к иммуноглобулинам кролика ("Novus", Канада), конъюгированные с флуорес-цеин изотиоционатом (FITC), и кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши ("Novus", Канада), конъюгированные с родамином. На препараты наносили по 50 мкл раствора первичных антител в 3% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, "HyClone", США) в концентрации 1 : 400 и оставляли инкубироваться в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки в трех сменах PBS по 5 мин повторяли инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре с раствором вторичных антител в 3% FBS (1 : 400). Затем отмытые в трех сменах PBS по 5 мин препараты окрашивали раствором DAPI в составе буфера для микро-скопирования Vectashield ("VectorLabs", США). Поле, в котором проходило иммунное окрашивание, накрывали покровным стеклом. Препараты хранили до микроскопирования в темноте при 4°С.
Визуализация флуоресцентных сигналов осуществлялась на микроскопе Axio Imager Z2 ("Zeiss", Германия) с автоматической системой регистрации препаратов Metafer ("Metasystems", Германия) при увеличении в 1000 раз. Съемка производилась с помощью трех фильтров (синий — DAPI, красный — родамин, зеленый — FITC). Съемка с помощью синего фильтра производилась в одной фокальной плоскости для получения контуров ядер клеток. На красном и зеленом фильтрах получали изображения с 15 фокальных плоскостей с шагом в 0.5 мкм между плоскостями с дальнейшим слитием в одно результирующее изображение. Учитывая, что средняя толщина ядер лимфоцитов составляет около 7 мкм, эта процедура позволила получить информацию о наличии флуоресцентных фокусов по всей толщине ядер клеток. На каждом препарате
производили оценку количества фокусов белков yH2AX, 53BP1 и колокализованных фокусов обоих белков в 100—200 клетках. Подсчет фокусов на полученных изображениях производили вручную.
Анализ частоты микроядер. Получение двухъ-ядерных клеток проводилось по стандартному протоколу [7]. 1.0—1.5 мл цельной крови культивировали при 37°С в питательной среде RPMI-1640 ("ПанЭко", Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Hy-Clone", США) и раствор аминокислот ("Sigma", США). В каждый флакон для стимуляции деления лимфоцитов вносили по 6 мл среды и 50 мкл фитогемаглютинина ("ПанЭко", Россия). Для накопления цитокинез-блокированных клеток в культуры лимфоцитов на 44-м ч культивирования добавляли цитохалазин В ("Sigma", США) до конечной концентрации 6 мкг/мл. На 72-м ч культивирования производили фиксацию клеток модифицированным фиксатором Карнуа (мета-нол:уксусная кислота — 3 : 1).
Для каждой полученной клеточной суспензии производили анализ пролиферативной активности, оцениваемой как доля лимфоцитов, прошедших деление в культуре (2-, 3- и 4-ядерные), относительно всех жизнеспособных клеток на препаратах, окрашенных красителем Гимза.
Анализ частоты микроядер проводили в комбинации с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), что позволило отдел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.