научная статья по теме ФОРМИРОВАНИЕ ДЛИННОПЕРИОДНОЙ ФАЗЫ В МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАНАХ ВЕРХНЕГО СЛОЯ КОЖИ (STRATUM CORNEUM) Химия

Текст научной статьи на тему «ФОРМИРОВАНИЕ ДЛИННОПЕРИОДНОЙ ФАЗЫ В МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАНАХ ВЕРХНЕГО СЛОЯ КОЖИ (STRATUM CORNEUM)»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 1, с. 123-128

ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ

УДК 577.352.2+538.9

ФОРМИРОВАНИЕ ДЛИННОПЕРИОДНОЙ ФАЗЫ В МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАНАХ ВЕРХНЕГО СЛОЯ КОЖИ (STRATUM CORNEUM)

© 2014 г. М. А. Киселев1, Е. В. Ермакова1, А. Ю. Грузинов2, А. В. Забелин2

1 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна E-mail: kiselev@nf.jinr.ru 2Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва Поступила в редакцию 09.04.2013 г.

Модельные мембраны SC — липидные мембраны, изготовленные из главных компонент липидной матрицы верхнего слоя кожи млекопитающих (stratum corneum — SC), используются для изучения общих закономерностей формирования наноструктуры липидной матрицы SC. Методом дифракции рентгеновского излучения исследована модельная мембрана верхнего слоя кожи SC c составом церамид 1/церамид 6/холестерин/пальмитиновая кислота/сульфат холестерина с массовым соотношением компонент 30/30/20/15/5. Показано, что структура исследуемой мембраны при pH = 7.2 состоит из двух короткопериодных фаз с периодами повторяемости d = 47 и d = 35.7 А, а также длин-нопериодной фазы с d = 127 А. При увеличении pH до 9.0 происходит разрушение длиннопериод-ной фазы, а короткопериодная фаза сохраняется с d = 48.3 А.

DOI: 10.7868/S0023476113060143

ВВЕДЕНИЕ

Верхний слой кожи млекопитающих stratum corneum (SC) состоит из умерших и ороговевших клеток (корнеоцитов) и липидной матрицы, в которой находятся сплющенные корнеоциты (рис. 1). Такая структура похожа на кирпичную стену, в которой роль кирпичей выполняют корнеоциты, а цементного раствора — липидная матрица. Липидная матрица SC является главным барьером для проникновения малых молекул через кожу человека и тем самым играет решающую роль в процессах диффузии лекарств через кожный покров, а также участвует в регулировании водного баланса организма за счет диффузии воды через SC [1]. Молекулы церамидов являются основным компонентом (до 47 мас. %) липидной матрицы SC.

На сегодня нет однозначного ответа о функции каждого церамида в формировании наноструктуры и свойств липидной матрицы SC [2]. Несмотря на отсутствие точных экспериментальных данных о роли каждого церамида в формировании свойств липидной матрицы SC на молекулярном уровне, церамиды все более широко применяются при производстве продукции крупными косметическими фирмами. Исследования модельных мембран SC c известным составом липидов позволяют получать информацию о свойствах отдельных церамидов в формировании общих свойств и структуры липидной матрицы SC. Это является преимуществом применения модельных мембран SC по сравнению с нативным SC или по сравнению с мембранами,

построенными из всего многообразия церамидов. В этом случае затруднительно выделить вклад отдельной молекулы в формирование структуры многокомпонентной липидной мембраны (ЛМ).

Общим утверждением является зависимость размера элементарной ячейки многослойной ЛМ от длины углеводородных хвостов молекул церамидов, входящих в состав мембраны. На основании этих общих свойств, молекулы длинноцепо-чечных церамидов 1, 4, 9 (рис. 2) должны формировать многослойные мембраны с большим периодом повторяемости d ~ 120—130 А (длинно-периодная фаза — ДПФ), а молекулы остальных

Корнеоциты

stratum corneum

Церамиды Жирные кислоты Холестерин Сульфат холестерина

Рис. 1. Структура верхнего рогового слоя (80) кожи. Внизу изображена структура липидного бислоя мембраны 80.

о

Сег 1 (Е08)

о

ны он

Сег 10 ~Н

Сег 11 (Л08)

Рис. 2. Молекулярная структура 11 типов молекул церамидов (Сег), представленных в коже млекопитающих. Цифровая номенклатура основана на хроматографическом анализе, буквенная — соответствует химической структуре.

о

ны

но

но

но

но

но

но

но

он

короткоцепочечных церамидов должны формировать мембраны с периодом повторяемости 50— 60 А (короткопериодная фаза — КПФ). Экспериментальные исследования по поиску ДПФ и КПФ в нативных и модельных мембранах дают противоречивые результаты. Исследования 8С, отделенного от кожи поросенка, методом нейтронной дифракции показали, что липидная матрица имеет многослойную структуру с периодом повторяемости 57 А в сухом состоянии и 62.8 А при полной гидратации [3]. Результаты рентгеновских дифракционных исследований свидетельствуют о том, что липиды, выделенные из 8С

Кристаллическая oQ.bG фаза, 50 А е4 Р А

Жидкая фаза, 30 А ; 0 А130 13

Кристаллическая фаза, 50 А

1 = Церамид 1, 4 О = Церамцд 2, 3, 5, 6, 7 у. = Холестерин

Рис. 3. Модель "сэндвича" длиннопериодной фазы липидной матрицы 8С.

млекопитающих, образуют многослойную ЛМ, состоящую из двух фаз с разными периодами повторяемости 64 и 130 А [4]. Исследования 8С, отделенного от кожи мышей, методом дифракции рентгеновских лучей на синхротронном источнике подтвердили существование двух фаз липид-ной матрицы: ДПФ, основанной на молекулах церамида 1 с периодом повторяемости 136 А и КПФ с периодом повторяемости, изменяющимся от 58 до 66 А при увеличении гидратации 8С от 10 до 80% [5]. Построение фурье-профилей плотности электронов по трем дифракционным пикам порошковой рентгеновской дифракции демонстрирует существование ДПФ в модельных мембранах с церамидом 1, приготовленных в избытке воды. При этом внутренняя структура липидного бислоя соответствует модели сэндвича [6]. Модель "сэндвича" липидной матрицы 8С, предложенная в [7], использовалась для объяснения результатов рентгеновских дифракционных экспериментов и экспериментов по электронной микроскопии, выполненных на многослойных мембранах, выделенных из эпидермального 8 С животных [4, 8]. По данным рентгеновской дифракции от неориентированных многослойных везикул (липосом) в избытке воды ДПФ липид-ной матрицы 8С состоит из трехслойной элементарной ячейки в 130 А с тремя внутренними слоями 50, 30 и 50 А (рис. 3) [4]. Слои толщиной 50 А

находятся в кристаллической фазе, а внутренний слой толщиной 30 Ä в жидкой (рис. 3). Последующие исследования модельных и выделенных ли-пидных мембран SC с более высоким пространственным разрешением (11 Ä) подтвердили модель "сэндвича" для ДПФ с элементарной ячейкой 130 Ä и тремя внутренними слоями 45, 40 и 45 Ä [9].

Исследования ориентированных и частично гидратированных мембран (состав церамид 1/це-рамид 6/холестерин/жирная кислота) методом дифракции нейтронов продемонстрировали, что наличие церамида 1 само по себе не приводит к возникновению ДПФ [10]. Мембраны, ориентированные на кварцевых подложках, имеют период повторяемости не более 50 Ä, что соответствует формированию КПФ. Таким образом, наличие в составе модельной мембраны SC церамида 1 является необходимым, но не достаточным условием образования ДПФ.

Исследования многослойных модельных мембран SC на кварцевых подложках показали, что их наноструктура определяется свойствами ко-роткоцепочечного церамида 6 [11]. Эта базовая наноструктура не может быть принципиально изменена ни введением в состав мембран длинноце-почечных жирных кислот [12, 13], ни длинноцепо-чечного церамида 1 [14]. Исследования методом дифракции нейтронов продемонстрировали, что молекулы церамида 6 создают сверхсильное взаимодействие, упрочняющее липидный бислой и стягивающее липидные бислои практически до стерического контакта друг с другом [15].

Эксперименты методом нейтронной дифракции требуют применения ориентированных мембран на кварцевых подложках. Такие мембраны гидратированы только частично. Высокие потоки рентгеновского излучения на установке ДИКСИ синхротронного источника Сибирь-2 НИЦ "Курчатовский институт" и на порядок более высокое разрешение в обратном пространстве (пространстве векторов рассеяния) позволяют проводить дифракционные эксперименты на неориентированных ЛМ (липосомах) в избытке воды [16]. Цель экспериментов — поиск в избытке воды ДПФ модельных мембран SC, ранее исследованных методами дифракции нейтронов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для приготовления модельной липидной матрицы SC использовались следующие основные компоненты: длинноцепочечные и короткоцепо-чечные церамиды (Cer 1 и Cer 6), холестерин (Ch), сульфат холестерина (ChS) и пальмитиновая кислота (PA). Cer 1 и Cer 6, предоставленные фирмой Evonik Goldschmidt (Essen, Germany), использовались без дальнейшей очистки. Ch, ChS, PA, а также вспомогательные вещества Trizma

HCl, Trizma Base, хлорид натрия (NaCl) и азид натрия (NaN3) были приобретены в "Sigma Aldrich". Для приготовления образцов использовалась де-ионизированная вода, очищенная на установке Millipore до 18 МОм • см, а также органические растворители метанол (CH3OH) и хлороформ (CHCl3).

Каждый липидный компонент растворяли в смеси органических растворителей метанол/хлороформ = 1/1. Концентрация липида в растворе составляла 10 мг/мл. Затем растворенные липиды смешивали в пропорции Cer1/Cer6/Ch/PA/ChS = = 30/30/20/15/5 мас. %. Полученную смесь выливали в чашку Петри и выпаривали органический растворитель при температуре 30°C до образования многослойной липидной пленки. Остатки органического растворителя удаляли, помещая материал в форвакуум на 12 ч. Сухой остаток ориентированных липидных слоев счищали шпателем в пробирку (Eppendorf).

Для проведения экспериментов по рассеянию синхротронного излучения в рентгеновском диапазоне образцы модельной мембраны SC готовили в виде многослойных везикул в избытке воды с заданным значением pH = 7.2 и 9.0. Буферные растворы готовились на основе солей Trizma HCl и Trizma Base с добавлением 100 мМ NaCl и 0.02 мас. % NaN3. Концентрация липидной смеси в воде составляла 20 мас. %. Для образования многослойных везикул полученную суспензию тщательно взбалтывали с использованием магнитной мешалки, нагревали до 80°C, а затем охлаждали до комнатной температуры. Цикл нагрев—охлаждение осуществляли несколько раз. Приготовленные образцы липидов SC помещали в кварцевые капилляры GLAS (Германия) диаметром 1.5 мм и толщиной стенки 0.01 мм. Густую смесь липидов спускали на дно капилляра с помощью центрифуги при частоте вращения ротора 1500 об/мин. Капилляры закрывали слоем пленки Parafilm для предотвращения испарения воды. Дальнейшее хранение образцов осуществлялось при комнатной температуре.

Э

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»