ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 1, с. 50-56
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ :
УДК 581.1
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ
ГРЕЧИХИ С РАЗНОЙ МОРФОГЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ © 2010 г. Н. И. Румянцева, А. Н. Акулов, Е. О. Федина, Н. В. Петрова, Ф. Г. Каримова
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань
Поступила в редакцию 05.12.2008 г.
В морфогенных каллусах гречихи татарской (Fagopyrum ?Шапеиш (Ь.) ОаегШ.) обнаружен более высокий уровень Са2+- и цАМФ-зависимого фосфорилирования внутриклеточных и внеклеточных белков по сравнению с неморфогенными каллусами. С помощью моноклональных антител РУ20 было показано, что морфогенные и неморфогенные культуры также различались между собой как по количеству белков, фосфорилируемых по остаткам тирозина, так и по степени их фосфорилиро-вания. В неморфогенных культурах по сравнению с морфогенными отмечено отсутствие фосфори-лирования по тирозину белка с мол. м. 21 кД и пониженное фосфорилирование белков с мол. м. 19, 22 и 29 кД. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что в культивируемых клетках, не способных к регенерации растений, происходят существенные изменения, как во внутриклеточной регуляции, так и в межклеточной коммуникации.
Ключевые слова: Fagopyrum 1а1апеит — морфогенные и неморфогенные культуры — проэмбриональные клеточные комплексы — внутриклеточные и внеклеточные белки — Са2+- и цАМФ-зависимое фосфорилирование белков — фосфорилирование по остаткам тирозина — регуляция морфогенеза
ВВЕДЕНИЕ
У организмов всех уровней организации фосфо-рилирование/дефосфорилирование белков является наиболее распространенным способом изменения активности ферментов и других белков, обеспечивая каскадную передачу сигналов от плазмалеммы к ядру [1]. Известно, что прохождение фаз клеточного цикла, рост, дифференциация и, в конечном счете, морфогенез достигаются за счет тонкой регуляции активности протеинкиназ и протеинфосфатаз, обеспечивающих необходимый уровень фосфорилирования белков по определенным сайтам. В клетках растений, так же как и в клетках животных, белки фосфорилируются, главным образом, по остаткам серина и треонина и минорно — по остаткам тирозина. Тем не менее, в клетках животных основной механизм трансмембранной трансдукции сигнала осуществляется именно за счет реакций фосфорилиро-вания/дефосфорилирования клеточных белков по остаткам тирозина и в меньшей степени — серина и треонина. Фосфорилирование белков по тирозину является критическим для пролиферации и диффе-
Сокращения: МК — морфогенный каллус, НК — неморфо-генный каллус, ПВДФ — поливинилдифторпирролидин-фосфат, ПВП — поливинилпирролидон, ПЭКК — проэм-бриональный клеточный комплекс, ФМСФ — фенилме-тилсульфонилфторид, TBS-T — Трис-буфер, содержащий соль и Твин (от Tris-buffered saline with Tween). Адрес для корреспонденции: Румянцева Наталья Ивановна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Электронная почта: nat_rumyantseva@mail.ru
ренциации клеток животных [2]. Нарушение баланса активности тирозиновых протеинкиназ и проте-инфосфатаз выражается в развитии таких серьезных заболеваний как рак, диабет, ревматоидный артрит и др. Следует отметить, что регуляция белков через фосфорилирование по тирозину и его функции в клетках растений мало изучены. Известно, что у растений фосфорилирование по тирозину важно для проявления активности протеинкиназ и фосфатаз, а также структурной стабилизации белков цитоскеле-та [3]. Имеется небольшое количество публикаций, в которых было предпринято изучение роли фосфо-рилирования по тирозину в регуляции физиологических процессов у растений [3—6].
Ранее нами было показано, что неморфогенные и морфогенные каллусы гречихи татарской могут быть удачной моделью для выявления морфологических, гистологических и физиолого-биохимиче-ских маркеров, связанных с дифференцировкой растительных клеток [7—9]. Мы не встречали работ, в которых проводили бы сравнение особенностей фосфорилирования белков в каллусах с разной мор-фогенной активностью, хотя эта информация является важной для расшифровки механизмов, регулирующих дифференциацию и морфогенез in vitro.
Цель данной работы состояла в изучении Са2+- и цАМФ-зависимого фосфорилирования, а также фосфорилирования по тирозину белков в морфогенных и неморфогенных культурах гречихи татарской.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследований использовали морфогенные и неморфогенные каллусы, а также неморфогенную суспензионную культуру гречихи татарской (Fagopyrum 1Шапсыт (Ь.) Оаейп.). Морфогенные каллусы были представлены линией 3+ (возраст культивирования 19 лет), линией 12-5 (возраст культивирования — 7 лет), линией 1-8 (возраст культивирования 2 года); неморфгенные каллусы — линией 3— (возраст культивирования 17 лет, отселек-тирован из морфогенной линии 3+) и линией NC65-С (возраст культивирования 7 лет); неморфо-генная суспензионная культура NC65-S (возраст культивирования 1 год) была получена из неморфо-генного каллуса линии NC65.
Морфогенные каллусы получали из незрелых зародышей, они состояли из проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) и участков мягкого каллуса. Морфология и получение таких культур были описаны нами ранее [10]. Различные линии морфо-генных каллусов отличались друг от друга по соотношению количества ПЭКК и мягкого каллуса, величине ПЭКК и окраске, но сохраняли типичную для них морфологию и способность к регенерации. Мор-фогенные каллусы гречихи татарской сохраняют морфологию, диплоидное число хромосом и способность к эмбриоидогенезу и геммогенезу в течение длительного времени культивирования (несколько лет) [7]. Неморфогенные каллусы отличаются от мор-фогенных каллусов рыхлой структурой, высокой скоростью роста, значительной генетической вариабельностью (хромосомные числа от 1я до 8я) и полной утратой способности к морфогенезу. Они формируются на морфогенных каллусах в виде отдельных клонов с частотой один случай на 30—40 пассажей культуры, в зависимости от линии каллуса [7]. Каллусные культуры поддерживали в темноте при температуре 26 ± 1°С на среде КХ, содержавшей минеральные соли среды Гамборга В5 [11] с добавлением (мг/мл): тиамина — 2, пиридоксина — 1, никотиновой кислоты — 1, гидролизата казеина — 2000, 2,4-Д — 2, ИУК — 0.5, НУК — 0.5, кинетина — 0.2, сахарозы — до 2.5% и 0.8% агара. Суспензионную культуру получали помещением кусочков неморфогенного каллуса в колбы с жидкой средой того же состава и выращиванием на качалке в темноте при температуре 26 ± 1°С. Морфогенные каллусы характеризовались способностью формировать эмбриоиды на безгормональной среде МС, а также почки на среде КХ с добавлением 6-БАП и ИУК [10]. Неморфогенный каллус пересаживали через каждые 3 нед., морфогенный каллус — через каждые 4 нед., суспензионную культуру — через 2 нед. Эксперименты проводили, используя культуры на стадии экспоненциального роста.
Для введения радиоактивной метки проводили предынкубацию каллусной ткани (500 мг) в течение 4 ч в жидкой среде КХ (4 мл) с добавлением 32Р-ме-ченной ортофосфорной кислоты (радиоактивность
2 МБк/ммоль при 25°С). Затем для удаления непоглощенной метки каллус дважды промывали свежей средой RX по 3 мин и культивировали в среде RX в течение 18 ч. Далее каллус отделяли от среды культивирования фильтрованием через двойной слой Mira-cloth, среду культивирования дополнительно пропускали через фильтр Millipore с диаметром пор 0.22 мкм. Чистоту фракции внеклеточных белков определяли по отсутствию активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [12]. Для экстракции внутриклеточных белков каллусную ткань, фиксированную в жидком азоте, гомогенизировали в буфере, содержавшем (мМ): Трис—HCl — 50, pH 7.5, сахарозу — 250, ЭДТА — 5, ДТТ — 1, фенилметилсульфонилфто-рид (ФМСФ) - 1, Na2WO4 - 10, теофиллин - 10; по-ливинилпирролидон (ПВП) — 3%; центрифугировали 10 мин при 12000 g и 4°С. Супернатант использовали как фракцию внутриклеточных белков. Содержание белка в обеих фракциях измеряли по методу Bradford [13], используя БСА в качестве стандарта.
Фосфорилирование белков in vitro определяли во фракции водорастворимых внутриклеточных белков каллуса (фракция внутриклеточных белков) и в среде культивирования каллуса (фракция внеклеточных белков). В реакционную среду, содержавшую 50 мкл фракции белков и 100 мкл раствора, включающего (мМ): Pipes — 50 (pH 6.5), MgCl2 — 5, ДТТ — 1 и теофиллин — 0.1, АТФ— 0.05, вносили активаторы фосфорилирования белков (цАМФ, Са2+, ЭГТА) и инкубировали при температуре 30°С 10 мин. Для определения цАМФ-зависимого фосфорилирования в инкубационную среду добавляли 1 мкМ цАМФ. После инкубации из каждой пробы наносили на фильтры (1 х 1 см) из хроматографической бумаги Whatmann 3MM по 50 мкл образца; фильтры промывали 4 раза сначала в 10% растворе ТХУ, затем в 5% растворе ТХУ (оба раствора содержали по 10 мМ ингибиторов фосфатаз Na4P2O7, KH2PO4 и Na2WO4) и, наконец, в 80% ацетоне, а затем быстро высушивали. Высушенные фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы и заливали 3 мл сцинтиллятора ЖС-1. Радиоактивность в имп./мин измеряли на радиометре "Delta-300" (США). Включение в белки выражали в имп./мин на 1 мг белка.
Для исследования фосфорилирования белков in situ по остаткам тирозина использовали монокло-нальные антитела PY20 ("Amersham", Великобритания). Каллусную ткань, фиксированную в жидком азоте, гомогенизировали (1 : 2) в среде, содержавшей (мМ): Трис—На — 50 (pH 7.5), ДТТ — 1, ФМСФ — 1, сахарозу — 250, теофиллин — 1, ЭДТА — 1, Na2WO4 — 0.1, ПВП — 3%. Гомогенат отжимали через 2 слоя Miracloth и центрифугировали 15 мин при 20000 g. Супернатант был затем использован для проведения одномерного электрофореза в 6—20% градиенте ПААГ. Приготовление образца для одномерного электрофореза проводили смешиванием суперна-
800
„ м 700 д ч
Ö ю 600
S 500 к
400 300 200 100
0
Без
воздействия 100 мкМ Ca2+
1 мкМ цАМФ 5 мМ ЭГТА
3000 2750
Л2500
0 5 2250
g ^2000 Л U
« S 1750
1 S 1500 ки
g Я 1250 S<1000
ce
Р
750 500 250
0
Î^J.
„2+
Без воздействия 100 мкМ Ca2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.