БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 867 - 881
УДК 579.69
ФОТОБИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ
Обзор
© 2015 А.Д. Исмаилов*, Л.Э. Алескерова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991; электронная почта: anvaris@list.ru
Поступила в редакцию 20.01.15 После доработки 02.03.15
Рассмотрены научные основы получения люминесцентных биосенсоров на основе свободных и иммобилизованных светящихся бактерий. Описаны современные технологии конструирования тест-объектов, процедур иммобилизации бактерий в различных носителях, процедур интегральной и специфической биодетекции токсинов. Проведен анализ данных по получению и использованию в биомониторинге экотоксикантов природных и генно-инженерных штаммов фотобактерий. Особое внимание уделено иммобилизации фотобактерий в криогеле поливинилового спирта. Описаны основные физико-химические, биохимические и технологические элементы стабилизации свечения бактерий в иммобилизованном состоянии. Представлены результаты применения иммобилизованных препаратов фотобактерий в дискретном и непрерывном биомониторинге различных классов экотоксикантов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биолюминесценция, биомониторинг, светящиеся бактерии, биосенсоры, иммобилизация, гели, поливиниловый спирт.
ФОТОБАКТЕРИИ В БИОМОНИТОРИНГЕ ЭКОТОКСИКАНТОВ
В научных и прикладных исследованиях биомониторинга широко используются аналитические системы, у которых в качестве сенсорного элемента функционируют различные ферментные системы, клетки и микроорганизмы. Особое внимание в последнее время уделяется биолюминесцентным биосенсорам на основе фотобактерий. Технология анализа основана на субстратном, ингибиторном или индукционном действии субстанций на специфические мишени биосенсоров, вызывающие изменения в энергетическом и/или структурном метаболизме клетки. Интенсивность свечения объекта служит количественным индикатором реакции биологического объекта на внешнее воздействие. Результаты исследований в этом направлении представлены в целом ряде обзоров, книг и статей [1—4].
Широта практического применения фотобактерий в биомониторинге окружающей среды связана с чувствительностью биолюминесцентной реакции клеток к широкому спектру веществ,
* Адресат для корреспонденции.
с цитотоксичным и(или) генотоксичным действием [5].
Трансформация фотобактериями химической энергии в световой сигнал осуществляется на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений стандартными фотодетекторами. Эмиссионный ответ для широкого круга токсических веществ хорошо коррелирует с реакцией стандартных биотестов на рыбах, ракообразных, простейших, — величина 50%-ного тушения свечения (ЕС50) коррелирует с величиной ЬБ-50 с коэффициентами корреляции 0,8-0,95.
В качестве биолюминесцентных тест-объектов в биомониторинге применяются различные типы природных и генно-инженерных микроорганизмов. Применение клеток для аналитических целей имеет ряд преимуществ по сравнению с бесклеточной системой, прежде всего, наличием высокой самопроизвольной эмиссии света и множественности мишеней для действия тех или иных химических агентов - токсинов, мутагенов, канцерогенов (ксенобиотики, тяжелые металлы, углеводороды), и физических факторов (иУ-излучения и других форм радиации).
В качестве люминесцирующих объектов в детекции токсичных веществ применяются как свободные, так и иммобилизованные фотобак-
терии [6, 7]. Реализован коммерческий выпуск тест-систем: «Microtox» («Azur Enviromental», США) [8], «Toxalert» («Merck», США) на основе бактерий Photobacterium phosphoreum [9], а также «Mitatox» (США) [10], «Vitotox» («GENAUR Molecular Products», Бельгия) [11] на основе Vibrio fis-cheri и др. Разработано получение лиофилизо-ванных и иммобилизованных клеток разных видов фотобактерий и технология применения этих препаратов для дискретного и непрерывного биомониторинга экотоксикантов [12, 13]. Значительная часть работ последних лет проведена на luxCDABE — маркированных штаммах E. coli и других видов бактерий в целях специфической детекции стрессовых состояний, ДНК повреждающих и мембранотропных агентов органической и неорганической природы [8, 14, 15].
Полученные к настоящему времени результаты позволяют рассматривать фотобактериальный тест в качестве универсального метода для широкомасштабного применения в комплексе мер экологического контроля за загрязнением окружающей среды. Разработанные технологии биолюминесцентного анализа в силу высокой чувствительности, быстродействия и экономичности по сравнению с другими биотестами, перспективны для экспресс-детекции гербицидов, инсектицидов и тяжелых металлов в почве, воде и препаративных формах, а также в контроле за процессами биотрансформации и деградации токсинов [10, 15, 16].
Технологиям конструирования микробных биосенсоров на основе фотобактерий посвящено значительное количество работ [4, 17, 18]. В рамках этих задач особое внимание уделено процедурам конструирования тест-объекта, систем биодетекции, технологиям применения препаратов. Эмиссионный ответ биосенсора рассматривается в двух режимах, — индуцибельном и конститутивном. При индуцибельном подходе репортерные lux-гены «сшиваются» со специфическими сенсорными генами, комплекс генов находится под общим промотором. Реакция промотора на определенные химические соединения приводит к индукции свечения. При конститутивном подходе репортерные lux-гены сцеплены с промотором, который экспрессиру-ется непрерывно. Оба типа биосенсоров постоянно совершенствуются, о чем свидетельствует возрастающее количество публикации. В значительной части работ основное внимание уделяется конструированию новых lux-маркирован-ных рекомбинантных штаммов, а также технологическим операциям иммобилизации клеток, процедурам хранения и использования биосенсоров в точечном и проточном биомониторинге токсикантов.
ТЕХНОЛОГИЯ ФОТОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ ТОКСИНОВ
Система биотестирования в техническом плане представляет собой комбинированный комплекс, состоящий из бактериального излучателя света и фотодетекторного преобразователя светового сигнала.
Светоизлучающие объекты: 1) природные светящиеся бактерии P. phosphoreum, Vibrio har-veyi, V. fischeri и др.; 2) специфические мутанты V. harveyi и V. fischeri; 3) рекомбинантные штаммы многих видов бактерий с клонированными генами люциферазы.
На клеточном уровне люминесцентный биосенсор включает в себя: 1) сенсорный элемент (S) и 2) репортерный элемент (R). Сенсорный элемент — структурные элементы клетки, отвечающие за взаимодействие с токсикантом. В природных штаммах, используемых для оценки интегральной (неспецифической) токсичности, сенсорными элементами являются плазматическая мембрана, цепи энергетического метаболизма, экспонированные в периплазму и внутриклеточные структурные компоненты, прямо или косвенно связанные с люминесцентной системой. Реакция биосенсора — тушение свечения. В мутантных и рекомби-нантных штаммах сенсорными элементами являются промоторы специфически экспрессиру-емых генов защиты от органических ксенобиотиков, тяжелых металлов, мутагенов, в том числе ДНК-повреждающих агентов, мембрано-тропных веществ, ингибиторов ферментов биосинтеза липидов, транспортных белков, белков теплового и окислительного стресса. Реакция биосенсора на химические агенты — активация свечения. Репортерный элемент природных фотобактерий композиционно состоит из 5 генов биолюминесцентного оперона — luxCDABE и регуляторных генов luxI и luxR, репортерным элементом генно-инженерных штаммов является беспромоторный транспозон luxCDABE. Генно-инженерный биосенсор обычно конструируется в виде единой структуры, состоящей из двух сцепленных генетических элементов с общим промотором, — специфического сенсорного, отвечающего за реакцию на химические агенты и индикаторного — люминесцентного.
Оптический детекторный элемент (D) — фотоэлектронные умножители или фотодиоды со спектральной областью чувствительности 400—700 нм.
Таким образом, система биомониторинга (SRD) основывается на двух последовательных преобразователях энергии: биологического, трансформирующего химическую энергию в световую, и фотоэлектронного, преобразующего световой поток в электрический сигнал.
БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ФОТОБАКТЕРИЙ
Биосенсоры, полученные на основе суспензии клеток обладают некоторыми недостатками: процедура вспомогательных и основных операций получения стандартных препаратов из лио-филизованных клеток отражаются на скорости анализа. Иммобилизованные клетки более экономичны и стандартны. Основные затраты как правило касаются технологии получения реком-бинантных штаммов. Кроме того, следует отметить, что эмиссия света при специфическом анализе на генно-инженерных штаммах наблюдается после многочасовой лаг-фазы.
Иммобилизация клеток фотобактерий и биолюминесцентной ферментной системы успешно реализована на различных типах неорганических и органических носителей. Использование препаратов с иммобилизованными клетками приводит к гетерогенному катализу, который создает во многих случаях экономическую и практическую эффективность. Преимущества, в первую очередь, касаются упрощения технологических операций, возможности перехода от периодических схем получения тех или иных продуктов или действия субстратов к непрерывным процессам. Во-вторых, иммобилизованные клетки дают возможность более длительной и многократной эксплуатации препаратов, в отличие от однократного применения клеток в гомогенном состоянии. Кроме того, технология иммобилизации препаратов позволяет во многих случаях увеличивать ферментативную активность. Иммобилизованные препараты обладают повышенной устойчивостью к различным физико-химическим факторам (температура, кислотность, рН), обладают меньшей чувствительностью к действию патогенных организмов. Иммобилизация фотобактерий позволяет повысить стабильность биосенсора при хранении и длительность его применения [19, 20]. Непрерывный биомониторинг токсинов также предъявляет повышенные требования к стабильности эмиссии света клетками тест-систем.
Как и в случае со свободными клетками, в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.