БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 882 - 890
УДК 577.352.2
ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ ГРАМИЦИДИНОВЫХ КАНАЛОВ В БИСЛОЙНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЕ: ЗАВИСИМОСТЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ ТУШИТЕЛЕЙ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА ОТ ЛОКАЛИЗАЦИИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА
© 2015 Т.И. Рокицкая*, А.М. Фирсов, Е.А. Котова, Ю.Н. Антоненко
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: rokitskaya@genebee.msu.ru
Поступила в редакцию 23.12.14 После доработки 27.02.15
Изучение ингибирования фотодинамической инактивации каналообразующего пептида грамицидина А двойными связями жирнокислотных цепей липидов выявило зависимость степени защиты грамицидина от глубины расположения фотосенсибилизатора в липидной мембране. Наибольшее защитное действие ненасыщенные липиды проявляли при фотодинамическом повреждении грамицидина, сенсибилизированном погруженным в толщу мембраны амидом диметилового эфира хлорина е6, наименьшее — в присутствии располагающегося на поверхности мембраны трижды сульфированного алюмофталоцианина. Глубину погружения фотосенсибилизаторов в мембрану оценивали по тушению их флуоресценции йодидом. Действие гидрофильного тушителя синглетного кислорода — аскорбата, напротив, было наиболее выражено в присутствии фталоцианина и меньше всего проявлялось в случае амида диметилового эфира хлорина е6. Различное защитное действие тушителей синглетного кислорода по отношению к фотодинамическому повреждению пептидов в мембране, очевидно, объясняется тем, что эффективность тушителей возрастает, если они располагаются ближе к фотосенсибилизатору.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фотодинамическое воздействие, грамицидин А, фотосенсибилизатор, ненасыщенные липиды, аскорбат, синглетный кислород, бислойная липидная мембрана.
Фотодинамическая терапия — перспективный метод лечения раковых заболеваний. В ее основе лежит селективное накопление фотосенсибилизаторов в опухолях и окислительное действие активных форм кислорода (в большинстве случаев синглетного кислорода), образующихся при возбуждении фотосенсибилизаторов светом видимого диапазона. Известно, что время жизни синглетного кислорода (102) в искусственных липидных мембранах больше, чем в водных растворах [1—3], что обуславливает взаимосвязь глубины погружения фотосенсибилиза-
Принятые сокращения: БЛМ — бислойная липид-ная мембрана; ФДВ — фотодинамическое воздействие; БРИРС — дифитаноилфосфатидилхолин; БОРС — диоле-илфосфатидилхолин; А1Ре83 — трижды сульфированный алюмофталоцианин.
* Адресат для корреспонденции.
торов в липидный бислой с эффективностью окисления различных мембранных молекул-мишеней [4—6].
Из-за высокого содержания в живых организмах и больших констант скоростей окисления некоторых аминокислот активными формами кислорода [1, 7, 8] белки являются основными мишенями синглетного кислорода и радикалов [9] при фотодинамическом воздействии (ФДВ). Многие работы указывают на то, что повреждение мембрано-связанных белков, таких как сукцинат дегидрогеназа, МАОИ дегидроге-наза и другие, играет ключевую роль при ФДВ на митохондрии и приводит к нарушению их функций [10, 11]. При окислении интегральных и периферических белков ненасыщенные липи-ды могут служить антиоксидантами и препятствовать потере функциональности таких белков [12].
Ранее было показано [13—16], что пептид грамицидин А, образующий ионный канал в ли-пидных мембранах и имеющий в своем составе четыре триптофана, инактивируется при ФДВ под действием синглетного кислорода, теряя способность образовывать канал. Эта модельная система оказалась очень удобной для исследования различных свойств фотосенсибилизаторов [17—21]. Недавно нами было показано, что ненасыщенные липиды защищают пептид грамицидин А от фотодинамического повреждения в присутствии борированного производного хлорина е6 (ВАСЕ [22]) и степень защиты растет с увеличением числа двойных связей в липиде [23]. В настоящей работе на примере фотоинактивации грамицидина в плоской бислойной ли-пидной мембране (БЛМ) мы изучили зависимость антиоксидантного действия ненасыщенного липида и аскорбата от степени погружения фотосенсибилизатора в мембрану. Для этой задачи были выбраны фотосенсибилизаторы разной гидрофобности: трижды сульфированный алюмофталоцианин, хлорин е6 и амид димети-лового эфира хлорина е6 (рис.1). Относительная глубина расположения хлоринов в мембране была оценена по тушению их флуоресценции йодидом калия. Сопоставляя результаты изменения фотоинактивации пептида при введении гидрофобных или гидрофильных тушителей синглетного кислорода для различных фотосенсибилизаторов, мы обнаружили значительные различия в действии тушителей. Оказалось, что антиоксидантное действие тушителей зависит
а
Рис. 1. Структурные формулы трижды сульфированного алюмофталоцианина (а), хлорина е6 (б) и амида диметилового эфира хлорина е6 (в)
от гидрофобности используемого фотосенсибилизатора, которая определяет глубину его локализации в липидной мембране.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
13(1)-М-(2-аминоэтил)-амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6, синтезированный как описано ранее [24], был предоставлен В.А. Ольшевской (Институт элементоорганичес-ких соединений им. А.Н. Несмеянова, РАН). Хлорин e6 и трижды сульфированный алюмо-фталоцианин (AlPcS3) были получены от «Porphyrin Products», США.
Бислойная липидная мембрана (БЛМ) сформирована из 2%-ного раствора дифитаноилфос-фатидилхолина (DPhPC) или диолеилфосфати-дилхолина (DOPC) («Avanti Polar Lipids», США) в декане на отверстии в перегородке, разделяющей на два отсека тефлоновую ячейку, содержа-ющую буферный раствор [25]. Диаметр отверстия составлял 0,5 мм. Грамицидин А («Sigma», США) добавляли из концентрированного раствора в спирте в водный раствор с двух сторон мембраны и тщательно перемешивали в течение 15 мин. Фотосенсибилизаторы добавляли из концентрированных растворов в воде или диме-тилсульфоксиде в водный раствор с транс-стороны мембраны (цис-сторона являлась передней стороной по отношению к лампе-вспышке) и тщательно перемешивали в течение 20 мин. Водный раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ
б в
Tris, рН 7,4. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (23—25°).
Электрический ток регистрировали в условиях фиксации потенциала. Разность потенциалов подавали на хлор-серебряные электроды, помещенные в тефлоновую ячейку. Ток измеряли с помощью усилителя Keithley 428 («Keithley Instruments Inc.», США), оцифровывали с помощью NI-DAQmx («National Instruments», США) и анализировали с использованием компьютерной программы WinWCP Strathclyde Electrophy-siology Software, написанной Дж. Демпстером (Университет Стратклайда, Великобритания).
БЛМ освещалась ксеноновой лампой-вспышкой с плотностью энергии около 400 мДж/см2 и длительностью меньше 2 мс. Стеклянный фильтр, отсекающий свет с длиной волны <500 нм, был помещен между вспышкой и ячейкой. Согласно ранее опубликованным данным [26], в присутствии фотосенсибилизатора одиночная вспышка света вызывала уменьшение электрического тока (I) через грамицидиновые каналы в мембране. Зависимость тока от времени хорошо описывалась моноэкспоненциальной кривой: I(t) = = (I, - I«) • exp(—t/т) + I«, где I0, I« и т - начальный ток до освещения, стационарный ток, установившийся после вспышки света, и характерное время фотоинактивации, соответственно. Относительная амплитуда фотоинактивации (а) определялась как а = (I0 — I«)/I0. Электрический ток был вызван приложенной к БЛМ разностью потенциалов в 50 мВ.
Липосомы приготавливали из яичного фос-фатидилхолина («Avanti Polar Lipids», США), суспендированного в растворе, содержащем 10 мМ Tris, 100 мМ KCl рН 7,4, с помощью миниэк-струдера («Avanti Mini-Extruder», «Avanti Polar Lipids», США), используя поликарбонатные фильтры с диаметром пор 100 нм (Nucleopore). Фотосенсибилизаторы добавляли к липосомам из концентрированных растворов и инкубировали в темноте 24 ч для достижения полного равновесного связывания. Для измерения тушения флуоресценции фотосенсибилизаторов йо-дид калия добавляли к суспензии липосом. Для предотвращения образования I2 при окислении I- к липосомам также добавляли Na2S2O3 (10—3 M). Интенсивность флуоресценции измерялась на флуориметре FluoroMax-3 («Horiba Jobin Yvon», Япония), A,ex = 407 нм.
Липосомы, нагруженные 5,6-карбоксифлуо-ресцеином («Sigma», США) в концентрации самотушения, были приготовлены из диолеил-фосфатидилхолина, суспендированного в 100 мМ растворе карбоксифлуоресцеина, методом экструзии через поликарбонатный фильтр (диаметр пор 100 нм). Полученные липосомы отмывали от
свободного карбоксифлуоресцеина пропусканием через колонку с сефадексом G-50, используя буфер 100 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ МЭС, рН 7,0. При измерении выхода карбоксифлуо-ресцеина липосомы разбавляли до конечной концентрации 5 мкг/мл в том же буфере, и флуоресценцию на длине волны 520 нм (возбуждение 490 нм) измеряли на флуориметре «Panorama» (Россия). Для возбуждения фотосенсибилизаторов с целью индукции фотодинамической пер-меабилизации липосомы освещали источником постоянного света - галогеновой лампой («No-vaflex», «World precision Instruments», США) с плотностью мощности 0,77 Вт/см2 в течение 60 с. В конце каждого опыта добавляли 0,1%-ный раствор Triton X-100 для регистрации полного выхода карбоксифлуоресцеина. Величина выхода карбоксифлуоресцеина вычислялась как (Ft — F))/(F100 — F0), где FoИ Ft — значения флуоресценции в начальный и произвольный момент времени, F100 — значение флуоресценции после полного выхода карбоксифлуоресцеина, вызванного добавлением Triton Х-100.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все изученные в данной работе фотосенсибилизаторы вызывали снижение индуцированного грамицидином А тока через БЛМ при освещении ее вспышкой света. На рис. 2 изображены примеры записей индуцированного грамицидином А тока через БЛМ, нормированного на начальный уровень (I/I0), в присутствии 0,5 мкМ амида диметилового эфира хлорина е6 (кривые 2,3 и 4) и без фотосенсибилизатора (кривая 1). В момент времени, равный 0, мембрана освещалась вс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.