ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2007, том 71, № 1, с. 145-149
УДК 535.37+535.34:541.14
ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ЛАЗЕРНАЯ ТЕРАПИЯ И ДИАГНОСТИКА ОБЛАСТЕЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ОПУХОЛЕЙ НА ОСНОВЕ НОВЫХ ТИПОВ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
© 2007 г. Е. С. Воропай1, М. П. Самцов2, К. Н. Каплевский1, Д. Г. Мельников1, Л. С. Ляшенко1
E-mail: voropay@bsu.by
Изучены закономерности протекания фотофизических и фотохимических процессов в молекулах новых симметричных индотрикарбоцианиновых красителей в растворах и биоструктурах. Установлены корреляция между эффективностью этих процессов и структурными особенностями строения молекул красителей, а также влияние на эти процессы физико-химических параметров среды и возбуждающего излучения.
Работа посвящена актуальной для человечества проблеме поиска эффективных путей диагностики, лечения и профилактики онкологических заболеваний. Метод фотодинамической лазерной терапии относится к числу нетрадиционных методов лечения и его развитию уделяют большое внимание в ведущих онкологических центрах мира. Метод фототерапии основан на использовании препаратов (фотосенсибилизаторов), которые, будучи относительно нетоксичными, приобретают выраженные цитотоксические свойства при возбуждении светом. В настоящее время фототерапию злокачественных новообразований с использованием в качестве фотосенсибилизаторов в основном соединений порфиринового ряда широко используют во многих странах мира. В странах СНГ используют, например, фотосенс, фотолон и некоторые другие [1-4]. Для большинства из пор-фириновых соединений фотоцитотоксическое действие связывается с участием синглетного кислорода, поэтому в условиях гипоксии эффективность таких препаратов значительно снижается. Максимум основной полосы поглощения порфириновых соединений ~670 нм. Использование излучения этого диапазона для возбуждения флуоресценции в диагностике сопряжено с возбуждением компонент биоткани, что оказывает мешающее влияние в определении области локализации опухолевых тканей.
Дальнейшие успехи фототерапии связывают с использованием нового поколения фототерапевтических препаратов, характеризующихся полосами поглощения в области "фототерапевтического окна" в спектральном диапазоне от 650 до 1000 нм. В этой области поглощение света компонентами
1 Белорусский государственный университет, Минск.
2 НИИ прикладных физических проблем им. А.Н. Севчен-
ко, Минск, Беларусь.
биотканей, такими как гемоглобин, меланин и вода, минимально и глубина проникновения света в ткань лимитируется в основном рассеянием, поэтому использование для фототерапии излучения данного спектрального состава обусловлено ориентацией на высокую эффективность лечения не только поверхностных, но и глубоко расположенных опухолей.
Данная работа посвящена изложению основных результатов по использованию в качестве фотосенсибилизаторов трикарбоцианиновых красителей, которые относятся к классу полиметиновых (цианиновых) красителей [5-10]. Эти красители имеют определенные преимущества перед соединениями порфиринового ряда. Так, цианиновые красители характеризуются максимальным поглощением света в более длинноволновой области (700900 нм), высоким молярным коэффициентом поглощения (>105 М-1 • см-1); некоторые соединения этого ряда проявляют выраженные фототоксические свойства и способность избирательного накопления в опухолевых клетках.
В работе исследовали синтезированные нами соединения, представляющие собой красители с тремя вениленовыми группами в полиметиновой цепочке и различными заместителями Я, (рис. 1).
Эффективность процессов протекающих в молекулах полиметиновых красителей (ПК) после поглощения кванта света в значительной степени зависит от состава сольватной оболочки. В связи с этим для определения процессов и механизмов взаимодействия красителей с различными биоструктурами были проведены исследования спектрально-люминесцентных характеристик молекул в различных растворителях, отличающихся физическими свойствами (полярностью, вязкостью и др.). ПК - это катионные соединения. Проанализированы свойства ПК при изменении вида анионов (Вг, I
146 ВОРОПАИ и др.
А1—(СИ=СИ) — СИ=А2
А
Ап
I
Л2
я
Ап
N I
я1
Рис. 1. Структура исследованных соединений.
и BF4) (красители ПК1, ПК2, ПК3 соответственно). В спиртовых растворах длинноволновые полосы поглощения имеют вид относительно узких полос (полуширина ~50 нм), а полосы флуоресценции примерно такой же полуширины смещены в длинноволновую сторону на ~25-30 нм. Такая форма полос характерна для красителей в мономерном состоянии.
В изотоническом растворе спектры поглощения всех исследованных соединений в диапазоне концентраций 10-7-10-3 М имеют характерные для образования ассоциатов молекул ПК особенности. По сравнению со спектрами в этаноле, где красители находятся в мономерном состоянии, на коротковолновом краю основной полосы поглощения присутствует дополнительный максимум, интенсивность которого сильно зависит от температуры и концентрации раствора. При введении в изотонический раствор 10% сыворотки крови спектры приобретают свойственную для мономеров форму, а максимум сдвигается в длинноволновую область.
В качестве модельных биоструктур в работе использованы клетки штамма ИвЬа, для которых проведен комплекс спектрально-люминесцентных исследований. Спектры поглощения и флуоресценции исследованных красителей в клетках при введении в диапазоне концентраций 2-10 мкг/мл близки по форме к спектрам в органических растворителях и в сыворотке крови. При таких концентрациях введения содержание красителей в клетках колеблется в пределах от 10-10 до 1.5 ■ 10-8 моль на 106 клеток. Увеличение концентрации красителей при введении выше 10 мкг/мл приводит к росту коротковолнового максимума и увеличению полуширины спектра, что свидетельствует об образовании ассоциатов. Однако такие высокие концентрации, близкие к порогу токсичности красителей, не представляют интереса для практического применения, а следовательно, и для исследований. Положения максимумов полос в клетках близки к спектрам поглощения красителей в органических малополярных растворителях, таких как хлористый метилен (ХМ) и дихлорбензол (ДХБ). В целом на основании проведенного анализа спектров поглоще-
Спектрально-люминесцентные характеристики красителей
Характеристики
Среда Анион ^макс , нм фл Лмакс , нм ^1/2 , нм ^ф/2, нм £, 10-5 М-1 ■ см-1 ффл (20°С) Р, % (15°С) т, нс (20°С)
ФР Вг, I, BF4 704 741 129 102 0.7 0.02 - 0.5
Этанол Вг, I, BF4 724 750 50 52 2.8 0.22 24.9 1.1
ДХБ Вг I BF4 742 741 740 764 767 765 83 60 55 66 59 54 1.5 1.6 1.7 0.45 0.42 0.38 16.0 16.1 17.5 1.9 1.8 1.6
НеЬа Вг BF4 738 739 766 765 60 56 66 60 2.0 2.0 0.23 0.22 36.2 36.4 1.4 1.4
Примечание. Концентрация красителей 10-6 М; ^флкс - длина волны максимума флуоресценции при Хвозб = 690 нм; ^акс - длина волны максимума поглощения; ффл - квантовый выход флуоресценции при Хвозб = 690 нм; Р - степень поляризации флуорес-
Л Л п Л Л фл _ Л Л фл
ценции при Авозб = ^макс и Лрег = А^акс ; т - время жизни молекул в первом возбужденном синглетном состоянии при Лрег = А^акс .
ния исследованных ПК в клетках HeLa и малополярных растворителях сделан вывод о том, что в клетках молекулы красителей локализованы в области с низкой диэлектрической проницаемостью и не контактируют с водой.
Для определения состояния красителя в биоструктурах наряду со спектральными измерениями проводили исследование поляризационных характеристик и временных параметров. Следует указать, что если измерения спектральных характеристик (спектры поглощения, возбуждения, поляризация P) проводили на серийно производимых приборах (спектрофотометр PV 1251А фирмы "Solar", спектрофлуориметр "Fluorolog" фирмы "Spex"), то кинетику затухания флуоресценции красителей анализировали с помощью разработанного нами импульсного спектрофлуориметра [11]. Он обеспечивает измерение кинетики в диапазоне от 0.5 до 120 нс с временным разрешением ~10-10 с. Выполненные измерения спектральных, поляризационных и временных характеристик сгруппированы в таблице для нескольких растворителей: дихлорбензола, этанола, физиологического раствора (ФР) и для клеточных структур HeLa. Данные приведены для симметричного катионного ин-дотрикарбоцианинового фотосенсибилизатора (сокращенное обозначение - ТИКС) с различными противоионами [12]. Результаты измерений спектров возбуждения и поляризации приведены на рис. 2.
Выполнены исследования динамики накопления препаратов в опухолевых клетках культуры HeLa при введении их в питательную среду. Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание препарата в клетках возрастает при времени инкубации до 1 ч, а затем остается примерно на одном уровне. Проведен скрининг фототоксичности полиметиновых красителей in vitro, и исследованы их фотофизические свойства в таких системах. На культурах двух штаммов опухолевых клеток HeLa и тороидальной меланомы проведено исследование фототоксичности полиметиновых красителей. Воздействие на монослой клеток, содержащий ПК, излучением в области поглощения фотосенсибилизаторов (для 17 из 18 исследованных красителей) приводит к гибели опухолевых клеток. Из числа 26 исследованных in vitro красителей выявлено 19, для которых фотовоздействие приводит к уменьшению числа жизнеспособных клеток более чем в 10 раз по сравнению с контролем. Показано, что в процессе фотовоздействия уменьшается концентрация красителей в клетках (число клеток не изменяется), что происходит вследствие необратимых фотопревращений молекул красителей.
Изучена фотоактивность ПК и с пониженным содержанием кислорода (гипоксии) в сравнении с фотосенсибилизатором порфиринового ряда хло-
D/Dmax 1.2
300 400 500
600 700
X, нм
800 900
Рис. 2. а - спектры возбуждения красителей: ПК1 (1, 4), ПК2 (2, 4), ПК3 (3,4) в ДХБ и этиловом спирте (4); и б - поляризационные спектры красителей: ПК1, ПК2 и ПК3 в этиловом спирте, Хрег = 750 нм (3); ПК1 в ДХБ, Хрег = 764 нм (2); ПК3 в ДХБ, Хрег = 764 нм (4); t = = 15°C.
рнном e6, механизм фотоактивности которого связан с образованием синглетного кислорода. Содержание фотосенсибилизатора в клетках не
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.