ВОДНЫЕ РЕСУРСЫ, 2009, том 36, № 5, с. 543-550
КАЧЕСТВО И ОХРАНА ВОД, ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
УДК 631.417.2:535.363
ФОТОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ВОДНЫХ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ1
© 2009 г. О. А. Трубецкой*, О. Е. Трубецкая**, К. Ришар***
*Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук 192290 Пущино, просп. Науки, 6 **Филиал Института биоорганической химии Российской академии наук 142290 Пущино, ул. Институтская, 2 ***Национальный центр научных исследований Франции ¥-63177 Клермон-Ферран, Обиер Поступила в редакцию 07.02.2008 г.
Сочетание методов гель-хроматографии на сефадексе и электрофореза в полиакриламидном геле использованы для получения стабильных электрофоретических фракций различного молекулярного размера из препарата гуминовых веществ, выделенного из речной воды с помощью обратного осмоса. Определена фотохимическая активность гуминовых веществ и их фракций. Впервые показана способность низкомолекулярных фракций водных гуминовых веществ интенсивно флюоресцировать и инициировать образование синглетного О2 при освещении полихроматическом светом, эффективно разрушая модельное соединение фурфурол. Фотохимическая активность и интенсивность флюоресценции высокомолекулярных фракций незначительна. Полученные данные помогут расширить современные представления в области гидрохимии природных вод о путях их естественного самоочищения от антропогенных поллютантов.
Гуминовые вещества (ГВ) представляют собой гетерогенную смесь темноокрашенных органических макромолекул сложного мономерного состава, содержащихся в водных и почвенных экосистемах, где они являются эффективным резервуаром С (до 60-70% Собщ почв и 60-90% Собщ, растворенного в природных водах), снижая эмиссию СО2 и парниковый эффект. Долгое время предполагали, что ГВ состоят из полидисперсных макромолекул, молекулярная масса которых достигает 300 кДа и, учитывая высокий отрицательный заряд ГВ, их нахождение в растворе зависит от рН среды [1, 22]. Благодаря новейшим методам исследования, адаптированным к таким комплексным соединениям как ГВ, сравнительно недавно была выдвинута новая концепция их молекулярной организации, основанная на представлении о супрамолекулярном строении ГВ, которые состоят из молекул относительно небольшого размера, соединенных между собой водородными, гидрофобными или п-п связями, а также поливалентными катионами [19-21]. При наличии внутригуминовых гидрофобных участков и внешних гидрофильных зон гипотеза о супро-молекулярном строении ГВ логично приводит к ми-целярной модели их организации в водной среде. Некоторые эксперименты с использованием
1 Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 06-04-48266) и ИНТАС (грант 05-8055).
флюоресцентных зондов подтверждают существование таких мицелл [12, 27, 28].
Около 25 лет назад было обнаружено, что водные ГВ способны не только связывать, но и эффективно трансформировать пестициды и другие пол-лютанты в менее токсичные вещества, используя в качестве источника энергии солнечный свет [29], причем эффективность деградации поллютантов гуминовыми веществами в природных водоемах на порядок превышает соответствующую активность микроорганизмов [8, 18]. Следует особо отметить, что в отсутствие ГВ значительное количество поллютантов не поддается существенной деградации под действием моно- или полихроматических источников света. Рядом авторов была продемонстрирована способность водных ГВ при облучении поли- и монохроматическим светом генерировать синглет-ный кислород [6, 9-11, 14, 15], который в свою очередь является сильным окислителем, осуществляя деградацию большого спектра органических соединений. Принимая во внимание, что структура макромолекул ГВ до настоящего времени неизвестна, весьма трудно представить и описать точный механизм фотохимических превращений поллютантов, а также идентифицировать интегральные структурные компоненты и хромофоры ГВ, осуществляющие эти реакции. Одним из подходов для решения этих проблем является разделение ГВ на фракции, имеющие различные физико-химические свойства и/или функциональную активность. Однако до на-
стоящего времени попытки обнаружить в составе водных ГВ стабильные фракции, имеющие постоянные физико-химические характеристики и повышенную по сравнению с исходным препаратом фотохимическую активность, были безуспешными [5]. Решение этого вопроса крайне важно для понимания механизмов и путей трансформации поллютан-тов в природных водах.
Сравнительно недавно была разработана новая методика электрофореза в полиакриламидном геле (ЭПАГ) в присутствии денатурирующих агентов, позволяющая разделять почвенные ГВ на три фракции [2], названные А, В и С + Д с точно определенными электрофоретическими подвижностями и молекулярными размерами (МР), которые уменьшались в последовательности МРА>МРВ>МРС + в. Одинаково обозначенные фракции ГВ различных почв имели сходные электрофоретические подвижности. Комбинация ЭПАГ и эксклюзивной хроматографии (ЭХ) на сефадексе (сочетание ЭХ-ЭПАГ) [25] позволила получить из нескольких различных по генезису почв препаративные количества фракций ГВ, резко различающиеся по молекулярным размерам и электрофоретической подвижности. В каждом исследуемом образце ГВ фракции при переходе от высоко- к низкомолекулярным имели сходную тенденцию в изменении весового содержания аминокислот [23], оптических свойств [26], фотоиндуктивных и флюоресцентных свойств [15, 24]. Было показано, что одинаково обозначенные фракции имели сходное происхождение (растительное или микробное) вне зависимости от генезиса почвы [17].
Предварительный сравнительный электрофоре-тический анализ целого ряда водных и модельных ГВ различного происхождения показал принципиальную возможность применения сочетания ЭХ-ЭПАГ для детального изучения водных ГВ [3, 13], а также для сравнения гуминоподобных веществ типа меланинов и лигнинов [16].
Цель настоящей работы - исследование спектральных характеристик, флюоресценции и фотохимической активности препарата ГВ, выделенного из вод р. Сувани (Джорджия, США) после его фракционирования с помощью сочетания ЭХ-ЭПАГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для исследования был взят препарат ГВ, полученный с помощью обратного осмоса [7] из воды р. Сувани летом 2002 г. Данный образец ГВ - стандарт Ш10Ш Международного общества гуминовых веществ (более подробную информацию о препарате можно найти на сайте www.ihss.gatech.edu ).
Сочетание ЭХ-ЭПАГ было использовано для получения препаративных количеств стабильных элек-трофоретических фракций ГВ по ранее описанной методике [2, 25]. Для фракционирования использо-
вали исходный недиализованный препарат ГВ. На колонку наносили 20 мг ГВ, растворенного в 1 мл раствора 7М мочевины. Хроматографию ГВ проводили на стеклянной колонке размером 1.5 х 100 см, заполненную предварительно набухшим в растворе 7М мочевины сефадексом G-75. На основании элек-трофоретического анализа из хроматографическо-го профиля было выделено три группы аликвот, отображающих при ЭПАГ-тестировке одну элек-трофоретическую зону в матрице полиакриламид-ного геля (ПАГ). Фракции (аликвоты) были диали-зованы в диализных мешках с номинальным размером пор 5 кДа и лиофилизованы. Препараты ГВ и их фракций хранили в сухом виде в плотно закрывающихся стеклянных баночках в темноте при комнатной температуре и использовали для дальнейших анализов.
Спектры поглощения в ультафиолетовой и видимой областях были получены на спектрофотометре Cary 3 (Уапап) в кварцевой кювете длиной 1 см. Препараты ГВ растворяли в 6.6 мМ фосфатном буфере (рН = 6.5) до концентрации 100 мг/л. Трехмерные флюоресцентные спектры были получены на спектрометре Ь8-55 (Регкт-Б1шег) с ксеноновым источником возбуждения. Спектры были нормированы на одинаковую концентрацию сухого вещества.
Для исследования фотохимической активности исследуемые препараты ГВ растворяли (С = 50 мг/л) в 3.3 мМ фосфатном буфере (рН 6.5), содержащем 0.5 х 10-4 М фурфурола (2-фуранметанола, С5Н6О2) в качестве субстрата, являющегося модельным соединением и окисляющимся в присутствии синглет-ного 02. Реакционную смесь помещали в прибор, оснащенный шестью ксеноновыми лампами, излучающими свет с длиною волны от 300 до 500 нм с максимумом при 365 нм. В этих условиях фурфурол не адсорбирует излучаемую энергию и не разрушается в отсутствии ГВ. В контрольном эксперименте при нахождении реакционной смеси в темноте препараты ГВ не разрушали фурфурол.
Для получения достоверных результатов для каждого препарата были определены как скорость разложения субстрата фурфурола, так и скорость образования фотопродукта. Кинетику реакции определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием обращенно-фазо-вой колонки Spherisorb 0Б8-2 с детекцией фурфурола и фотопродукта при 220 нм. Были определены кажущиеся константы скорости реакций 1-го порядка деградации фурфурола и образования фотопродукта, на основании которых оценивали эффективность образования синглетного О2 в присутствии исследованных препаратов ГВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях исходного и
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектры поглощения в ультрафиолетовой и
видимой областях исходного 1 и диализованного 2
препаратов ГВ (С = 100 мг/л) из р. Сувани.
диализованного препаратов ГВ из р. Сувани. После диализа коэффициент поглощения А300 препарата увеличился в 1.5 раза, а коэффициент цветности А300/А400 - соотношение поглощений при 300 нм и при 400 нм - снизился с 4.75 до 3.78 (таблица), что, возможно, обусловлено обогащением препарата ГВ высокомолекулярными окрашенными веществами в процессе диализа и удалением низкомолекулярных неокрашенных или слабо окрашенных веществ, поглощающих в ультрафиолетовой области.
Электроферограммы исходного и диализованного препаратов ГВ показаны на рис. 2. Оба препарата образуют естественно окрашенные электро-форетические зоны, обозначенные А, В и С + В, причем после диализа интенсивность окраски всех электрофоретических зон увеличилась, что находится в соответствии с увеличением
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.