научная статья по теме ФРАГМЕНТЫ ДНК, ОБНАРУЖИВАЕМЫЕ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В АДАПТИРУЮЩИХ ДОЗАХ, ЯВЛЯЮТСЯ ФАКТОРОМ СТРЕСС-СИГНАЛИЗАЦИИ МЕЖДУ ЛИМФОЦИТАМИ И КЛЕТКАМИ-СВИДЕТЕЛЯМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ФРАГМЕНТЫ ДНК, ОБНАРУЖИВАЕМЫЕ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В АДАПТИРУЮЩИХ ДОЗАХ, ЯВЛЯЮТСЯ ФАКТОРОМ СТРЕСС-СИГНАЛИЗАЦИИ МЕЖДУ ЛИМФОЦИТАМИ И КЛЕТКАМИ-СВИДЕТЕЛЯМИ»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 2, с. 133-140

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ^^^^^^ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

УДК 539.1.04:577.21:576.32/36

ФРАГМЕНТЫ ДНК, ОБНАРУЖИВАЕМЫЕ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ В АДАПТИРУЮЩИХ ДОЗАХ, ЯВЛЯЮТСЯ ФАКТОРОМ СТРЕСС-СИГНАЛИЗАЦИИ МЕЖДУ ЛИМФОЦИТАМИ И КЛЕТКАМИ-СВИДЕТЕЛЯМИ © 2007 г. А. В. Ермаков, С. В. Костюк, Н. А. Еголина, Е. М. Малиновская,

H. Н. Вейко*, Д. М. Спитковский

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

При развитии адаптивного ответа прицентромерные локусы гомологичных хромосом перемещаются из примембранных областей ядра клетки и сближаются для возможной репарации двунитевых разрывов ДНК в процессе гомологичной рекомбинации. После воздействия рентгеновского излучения в адаптирующей дозе (10 сГр) транспозиция прицентромерных локусов хромосом и сопровождающая ее активация ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом наблюдались в облученных Gcглимфоцитаx, а затем и в интактных клетках-свидетелях, инкубированных в ростовой среде экспонированных лимфоцитов (эффект "свидетеля", ЭС). Для проявления ЭС количество облученных клеток могло быть на три порядка меньше числа клеток-свидетелей. Из среды культивирования облученных и интактных лимфоцитов выделены фрагменты ДНК, которые в независимых экспериментах вводили в среду необлученных клеток. При этом в лимфоцитах-свидетелях наблюдается транспозиция локусов гомологичных хромосом и активация ЯОР хромосом; после инокуляции фрагментов ДНК необлученных клеток оба эффекта отсутствуют. Обсуждаются характеристики выявленных факторов и возможные для них пути в стресс-сигнализации между облученными лимфоцитами и клетками-свидетелями.

Рентгеновское излучение, малые дозы, транспозиция локусов хромосом, адаптивный ответ, эффект свидетеля, факторы стресс-сигнализации.

В 1992 г. Нагасава и Литтл [1] описали увеличение частоты сестринских хроматидных обменов (СХО) в 20-40% клеток яичника китайского хомячка после облучения, когда только 0.1-1% клеточных ядер пройдены а-частицами. Эти результаты были подтверждены другими исследователями на диплоидных фибробластах человека [2]. Обнаруженный эффект назвали эффектом "свидетеля" (ЭС, bystander effect). ЭС - сложная клеточная реакция, при которой после повреждающего воздействия происходит передача сигнала от облученных клеток к необлученным (клеткам-свидетелям), в результате чего в тех и других клетках индуцируются одинаковые эффекты. ЭС обнаружен для разных типов клеток млекопитающих и для радиации разных типов (а-, в-, у- и Х-излучения) в широком диапазоне доз [3-5]. ЭС инициируют также ультрафиолетовое (УФ) излучение [6], тяжелые ионы [4], компоненты фотодинамической терапии и высокотемпературное воздействие [7], химические соединения и измене-

*Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1, МГНЦ РАМН; тел.: (495) 111-85-76; факс: (495) 324-07-02; e-mail: ribgene@rambler.ru.

иия концентрации глюкозы, осмолярности и давления кислорода [3]. В клетках-свидетелях наблюдали индукцию хроматидных аберраций и СХО, мутации, клеточную трансформацию, изменения генной экспрессии, нестабильность генома, образование микроядер, апоптоз и адаптивный ответ (АО) [3, 4, 8, 9]. Для ЭС предполагают существование нескольких путей передачи стресс-сигнала [3, 4, 8]: образование в местах соприкосновения соседних клеток общих мембранных структур (клеточный контакт); взаимодействие между клетками с участием канал-формирующего компонента - коннексина 43 (gap-junction intercellular communication, GJIC); секреция облученными клетками в среду культивирования факторов стресс-сигнализации (distant cell signaling intercellular communication, DSIC [10]).

Механизмы передачи клеткам-свидетелям информации о радиационном воздействии активно изучаются. В случае GJIC определенную роль играют клеточные сигнальные регуляторы: калмо-дулин, ионы Са2+, циклические нуклеотиды и метаболиты. Факторы стресс-сигнализации при этом типе межклеточных взаимодействий имеют

диаметр менее 2 нм и молекулярную массу 2 кДа [3]. Оксиданты внутри- и внеклеточного происхождения, такие как реакционноспособные кислородные (ROS) или азотные (NOS) соединения, по-видимому, принимают участие в ЭС, поскольку проявления ЭС ингибируются в присутствии антиоксидантов или ингибиторов перекисных соединений и продуктов NO-радикалов [11-15]. Добавление в среду культивирования облученных клеток Cu-Zn-супероксиддисмутазы и каталазы снижает частоту образования микроядер, индукцию белка p21Wafl и локусов возникновения фос-форилированной формы гистона Н2АХ, что указывает на сигнальный путь с участием окислительного метаболизма [16]. Обнаружено также, что в ЭС существенную роль играет сигнальный каскад с участием циклооксигеназы 2 (СОХ-2) [17]. Повышение уровня содержания ROS коррелирует с усилением секреции цитокинов: фактора некроза опухоли, интерлейкина 1, интерлейкина 8 и фактора роста в1 [18]. При активации ЭС in vitro в клетках млекопитающих усиливается секреция белков р53, CD95 (АРО-1/Fas) и каспазы 8 [3].

Несмотря на активные исследования в этом направлении, природа всех факторов сигнальной системы при ЭС до конца неясна. Основное внимание сосредоточено на факторах белковой природы, которые могут экскретироваться облученными клетками и при взаимодействии с клеточными рецепторами клеток-свидетелей активировать сигнальные пути, сопровождающиеся синтезом активных форм кислорода. На роль этих факторов предполагали белки эпителия [19], белки с молекулярной массой около 10 кДа [9, 20], факторы роста (например, TGF-^1), цитокины [3]. В работе [21] проанализировали уровень экспрессии около пяти сотен белков, однако в процессе развития ЭС заметных количественных изменений в этом довольно широком белковом спектре авторы не наблюдали. Вместе с тем в последние годы появляются данные о том, что фрагменты ДНК с определенными последовательностями при взаимодействии с соответствующими рецепторами клеток активируют белки семейства стресс-ассо-циированных протеинкиназ (МАРК) [22], что сопровождается продукцией цитокинов и выработкой активных форм кислорода. Мы предположили, что фрагменты ДНК, которые ранее были обнаружены нами в среде культивирования облученных клеток [20], могут рассматриваться как потенциальные факторы сигнализации при ЭС. В данной работе мы показали, что фрагменты внеклеточной ДНК среды культивирования облученных лимфоцитов вызывают в необлученных клетках изменения, аналогичные изменениям в облученных клетках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Выделение лимфоцитов. Нестимулированные Go-лимфоциты человека выделяли в системе фи-колл-урографин [23] из гепаринизированной периферической крови здоровых доноров.

Облучение клеток. Лимфоциты (в 200 мкл раствора Хенкса) облучали при 20°С на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Амплитуда напряжения на рентгеновской трубке ~160 кВ, максимум в спектре излучения ~60 кэВ [24]. Дозиметрию проводили при помощи термолюминисцентных кристаллов типа "TLD-700" ("Harhaw", США) интегральным методом c применением дозиметров "ДРГ-05М1" (СССР) и накопительного типа "КИД-2" (СССР). Мощность дозы составляла 0.16 Гр/мин.

Культивирование клеток (эффект свидетеля). Лимфоциты переводили в среду, содержащую раствор Хенкса, 1 ммоль/л HEPES ("Fluka") и 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Hy-Clone", США), и делили на две части. Первую часть - контрольные (106 клеток/мл) и облученные (10 сГр) клетки (106, 105 и 104 клеток/мл) - инкубировали при 37°С. Через 3 ч клетки удаляли центрифугированием, подвергали гипотонии и фиксации. В полученные супернатанты помещали вторую часть лимфоцитов, интактные клетки (106 клеток/мл) и инкубировали также 3 ч при 37°С, после чего лимфоциты осаждали, гипотонирова-ли и фиксировали. В третьем варианте опытов облученные (10 сГр) и интактные клетки инкубировали 3 ч при 37°С, затем центрифугировали и супернатанты замораживали; в других независимых экспериментах из этих размороженных препаратов выделяли фрагменты ДНК и добавляли к культуральной среде, содержащей только что выделенные лимфоциты того же донора. После 3 ч инкубации (37°С) лимфоциты осаждали, подвергали гипотонии и фиксировали.

Приготовление клеточных препаратов. Лимфоциты осаждали центрифугированием. Клетки инкубировали в течение 20 мин при 37°С в 0.075 моль/л растворе KCl и 10 мин центрифугировали. Полученные осадки гипотонированных лимфоцитов переводили в холодную фиксирующую смесь метанол:ледяная уксусная кислота (3:1) и центрифугировали, повторяя эту операцию дважды. Переведенный в малый объем фиксатора клеточный материал переносили на влажные охлажденные предметные стекла и высушивали. Часть препаратов через 10 сут подвергали окраске азотнокислым серебром, используя разработанную ранее методику [25]. Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь не менее чем в 150 интерфазных ядрах.

Нерадиоактивная флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Использовали зонд на при-

центромерный локус первой хромосомы (1q12). Его наносили на препарат и под покровным стеклом проводили денатурацию 7 мин при 74°С в термостате "ThermoBrite" ("StatSpin", США). Ре-натурацию осуществляли во влажной камере при 40°С в течение ночи. После этого стекла выдерживали 7 мин при 42°С в растворе, содержащем 2-кратный SSC и 50%-ный формамид, затем в течение 5 мин при той же температуре в растворе SSC 2-кратной концентрации и 1 мин в 0.1 моль/л Na-фосфатном буфере с рН 8, содержащем 0.1% твин-20 (буфер А). На стекла наносили авидин-флюоресцеинизотиоцианат (FITC) в буфере А и инкубировали в течение 30 мин во влажной камере при 37°С, после чего отмывали 2 раза по 10 мин буфером А. Далее наносили на стекла раствор йодида пропидия и диаминофенилиндола (DAPI). Препараты накрывали покровными стеклами и изучали под микроскопом.

Анализ изображений. Для сканирования изображения клеток использовали микроскоп "Axio-plan" ("Opton", Германия) и цифровую камеру "RETIGA 2000R" ("IMAGING", Канада). Перевод двумерного изображения в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»