РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2008, том 48, № 5, с. 553-564
АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ
УДК 576.5:575.826:612.112.94:612.014.04:535-34
ФРАГМЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ИЗ СРЕДЫ ИНКУБИРОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ОБЛУЧЕННЫХ В МАЛЫХ ДОЗАХ, ЗАПУСКАЮТ РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В НЕОБЛУЧЕННЫХ ЛИМФОЦИТАХ-СВИДЕТЕЛЯХ
© 2008 г. А. В. Ермаков, М. С. Конькова, С. В. Костшк, Е. С. Ершова,
Н. А. Еголина, Н. Н. Вейко*
ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Рентгеновское излучение (10 сГр) индуцирует в лимфоцитах человека перемещение локусов гомологичных хромосом от мембраны к центру ядра и активацию ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом. Эти эффекты передаются посредством фрагментов внеклеточной ДНК (вкДНК) необ-лученным клеткам (эффект свидетеля, ЭС). Мы показали, что в развитии ЭС важная роль принадлежит окислительному стрессу, который индуцируется радиацией в малых дозах и фрагментами вкДНК среды культивирования облученных клеток; ферменту апоптоза каспазе 3; ДНК-связываю-щим рецепторам клеток-свидетелей, предположительно TLR9. Предложена схема развития адаптивного ответа и ЭС при действии радиации. Ионизирующее излучение вызывает апоптоз радиочувствительной фракции клеток вследствие развития "первичного" окислительного стресса. Фрагменты ДНК апоптотических клеток выделяются в межклеточное пространство и взаимодействуют с ДНК-связывающими рецепторами клеток-свидетелей. Это взаимодействие активирует в лимфоцитах сигнальные пути, связанные с синтезом активных форм кислорода и азота, т.е. индуцирует повторный окислительный стресс, который сопровождается апоптозом части клеток и т.д. Таким образом, после однократного воздействия радиации в клеточной популяции достаточно долго может поддерживаться окислительный стресс, способствующий развитию адаптивного ответа. ВкДНК апоптотических лимфоцитов является одним из значимых факторов стресс-сигнализации.
Лимфоциты человека, внеклеточная ДНК, малые дозы рентгеновского излучения, транспозиция локусов хромосом, окислительный стресс, адаптивный ответ, эффект свидетеля, апоптоз, tolllike рецепторы.
В 50-х годах прошлого века было обнаружено, что клетки млекопитающих, синтезируя факторы сигнализации, могут оказывать влияние на другие клетки [1]. Постепенно в литературе появлялись все новые сведения подобного рода (см. обзор [2]), в том числе и о накоплении со временем в плазме крови облученных пациентов некоторых кластогенных факторов. В 1992 г. Нагаса-ва и Литтл экспериментально воспроизвели явление межклеточной сигнализации при действии радиации. После облучения 0.1-1% клеточных ядер культуры клеток китайского хомячка сестринские хроматидные обмены (СХО) были обнаружены в 20-40% клеток [3], т.е. информация о факте облучения передалась от экспонированных клеток - необлученным (клеткам-свидетелям). Эта клеточная реакция получила название эффекта свидетеля (ЭС). Данный феномен под-
*Адресат для корреспонденции: 115478 Москва, ул. Москворечье, 1, МГНЦ РАМН; тел.: (499) 612-81-93; факс: 324-0702; e-mail: ribgene@rambler.ru
твержден для повреждающих агентов разной природы, многих типов клеток, а также для ряда передаваемых реакций и эффектов [4-7].
Малые дозы ионизирующей радиации, как правило, индуцируют в клетке адаптивный ответ (АО) - выработку устойчивости к последующему облучению в высоких дозах [8, 4]; впрочем, встречаются исключения [9]. Показано, что АО может передаваться от облученных клеток интактным по механизму ЭС. Так, после воздействия у-излуче-ния (1 сГр) или среды культивирования облученных ранее в той же дозе клеток на фибробласты НРЬ-1 легкого человека наблюдалось повышение выживаемости как ранее экспонированных клеток, так и интактных клеток-свидетелей при последующем облучении в дозах 2 и 4 Гр [10]. Сходные результаты представлены в более поздней работе, где источником адаптирующего (2 сГр) и повреждающего воздействия (4 Гр) являлось рентгеновское излучение [11]. Многие авторы отмечают наличие характерных признаков, указы-
вающих на внутреннюю взаимосвязь АО, ЭС [1214] и геномной нестабильности [15-17]. Эта связь отражена в биологически обоснованной модели доза-ответ '№0ТКА^2" и 'т0таА^3" [18].
Ионизирующая радиация оказывает как прямое воздействие на клеточные структуры при попадании кванта энергии или частицы, так и непрямое, которое опосредуется свободными радикалами [19]. В процессе ионизации синтезируются активные формы кислорода (АФК) и азота (АФА). Процесс их образования после воздействия радиации (как с высокой, так и низкой ЛПЭ) занимает с началом экспозиции в клетках разных типов от нескольких секунд до 2-5 мин после воздействия радиации [20], хотя время жизни отдельных АФК и АФА после облучения в биологических субстратах колеблется от 10-1 с (для N00 до 10-9 с (для *ОН) [21]. Образовавшиеся АФК и АФА вызывают множественные повреждения ДНК: модификацию оснований, межуглеродные разрывы в дезоксирибозе, возникновение апуриновых и апиримидиновых сайтов, одно- и двунитевые разрывы, сшивки ДНК-белок и т.д. [22, 23]. Показано, что в процессе ЭС, индуцированного воздействием а-частиц, АФК активно участвуют в образовании СХО, причем запускается сигнальный путь, ведущий к накоплению белков р21та1 и р53, а также микроядер [24, 25].
При этом не требуется прямое попадание а-частиц в ядро или клетку: облучение цитоплазмы микропучком а-частиц приводит к повышению частоты мутаций в клетках за счет генотоксиче-ского действия АФК [26], поскольку спектр таких мутаций отличается от образующихся при воздействии радиации на ядро и похож на спектр мутаций, которые спонтанно возникают в процессе эндогенного метаболизма [27]. Аналогичные данные приводят авторы, показавшие, что в клетках радиорезистентной глиомы хромосомные повреждения инициируются в клетках-свидетелях в случае облучения только цитоплазмы [28]. Таким образом, АФК принимают непосредственное участие в ЭС, индуцированном действием ионизирующей радиации [6, 7, 29-33].
Возникает вопрос о происхождении в среде облученных клеток факторов, которые индуцируют в клетках-свидетелях выработку АФК. Ряд данных указывает, что возможным источником таких факторов могут быть радиочувствительные клетки, гибнущие при действии радиации. Так, при фагоцитозе апоптотических телец освобождается фактор, приводящий к гибели по механизму апоптоза других клеток [34]. Супрессоры апоптоза Ь-депренил (ингибитор моноаминокси-дазы) и лактат могут эффективно подавлять ЭС [35, 36]. Ранее мы показали, что фрагменты внеклеточной ДНК (вкДНК), переходящие в среду культивирования из апоптотических клеток, мо-
гут быть одним из возможных компонентов, отвечающих за возникновение ЭС. В лимфоцитах-свидетелях эти фрагменты стимулировали развитие тех же реакций, что и в экспонированных клетках: изменение локализации прицентромер-ного гетерохроматина 1-й хромосомы и изменения конформации ядрышка [4, 5, 37].
Логично предположить, что фрагменты вкДНК являются одним из факторов, индуцирующих в клетках-свидетелях выработку АФК. Последние, в свою очередь, вызывают реакции, наблюдаемые в ЭС. Чтобы доказать это предположение, мы провели две группы опытов: сравнили действие на лимфоциты радиации в малых дозах, Н2О2 в малых концентрациях и действие фрагментов вкДНК, выделенных из среды культивирования клеток, подвергнутых воздействию излучения или Н2О2; исследовали реакцию лимфоцитов на перечисленные выше воздействия в присутствии ингибитора окислительного стресса (ОС) - а-то-коферола.
Н2О2 - электростатически нейтральная молекула и легко проникает сквозь гидрофобные мембраны в клетки и ткани [21], повреждает ДНК и индуцирует гибель клеток по механизму апоптоза [38, 39]. Таким образом, свойства Н2О2 позволяют использовать ее в качестве вещества, имитирующего воздействие ионизирующего излучения, при котором в клетке возникают АФК, индуцирующие АО и ЭС.
В результате проведенного исследования предложена гипотетическая схема реализации ЭС в культуре лимфоцитов при действии ионизирующего излучения в малых дозах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов. Нестимулированные в0-лимфоциты выделяли путем центрифугирования в системе фиколл-урографин ("Панэко", Россия) из гепаринизированной периферической крови здоровых доноров.
Облучение клеток. Лимфоциты облучали при 20°С на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Амплитуда напряжения на рентгеновской трубке =160 кВ, максимум энергии в спектре излучения =60 кэВ, мощность дозы 0.16 Гр/мин.
Инкубация клеток с перекисью водорода. Н2О2 вводили в среду культивирования лимфоцитов в концентрации 10 мкмоль/л [21] и инкубировали 2 ч при 37°С.
Ингибирование окислительного стресса. Из 10%-ного масляного раствора а-токоферол ацетата ("Галено Фарм", Санкт-Петербург) готовили спиртовой раствор и вводили его в среду культивирования лимфоцитов в конечной концентрации 100 мкмоль/л.
Активность каспазы 3 подавляли введением в культуральную среду ингибитора этого фермента - Biotin-DEVD-FMK ("Sigma") в концентрации
2 мкмоль/л [40].
Связывание вкДНК с рецепторами TLR9 блокировали олигонуклеотидом 2088 (TCC TGG CGG GGA AGT, "Синтол", Москва) в концентрации
3 мкг/мл [41] или хлорокином ("Boots Company PLC", Англия) в концентрации 2 мкг/мл [42]. После добавления каждого из двух агентов клетки инкубировали до какого-либо воздействия 30 мин при 37°С.
Выделение фрагментов ДНК из среды инкубации лимфоцитов. Клетки осаждали центрифугированием (460 g) и к 3 мл среды культивирования добавляли в конечной концентрации: 1%-ный лаурилсаркозинат натрия, 0.02 моль/л ЭДТА и 75 мкг/мл РНКазы А ("Sigma"). Суспензию клеток инкубировали при 37°С 45 мин, затем после прибавления протеиназы К (200 мк/мл) еще 24 ч. Далее насыщенным раствором фенола проводили экстракцию ДНК и осаждали ее этанолом в присутствии 2 моль/л раствора ацетата аммония. Осадок промывали 75%-ным этанолом, высушивали и растворяли в воде. Концентрацию ДНК определяли методом флуоресценции красителя Hoechst 33528, связанного с ДНК.
Культивирование клеток для выявления эффекта свидетеля. Лимфоциты переводили
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.