ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2008, № 12, с. 1466-1474
ХИМИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ ПОЧВ
УДК 631.4
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ГИДРОФОБНОСТИ, РАЗМЕРУ И ЗАРЯДУ
МЕТОДОМ ВЫСАЛИВАНИЯ*
© 2008 г. А. Г. Заварзина1, Н. Г. Ванифатова2, А. А. Степанов1
1Факулътет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы 2Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского, 119995, Москва, ул. Косыгина, 19
E-mail: zavarzina@mail.ru Поступила в редакцию 05.10.2007 г.
В работе показано, что высаливание сульфатом аммония дает возможность быстрого препаративного фракционирования гуминовых кислот одновременно по ряду признаков: 1) относительной гид-рофобности молекул; 2) молекулярному размеру; 3) величине заряда, зависящего от количества функциональных групп. Установлено, что высаливание при самой низкой и самой высокой степенях насыщения сульфатом аммония, при которых происходит осаждение компонентов данного препарата, позволяет получить контрастные по функциональным свойствам фракции: высокомолекулярную (гидрофобную) и низкомолекулярную (гидрофильную). Первая из фракций характеризуется наиболее низкой электрофоретической подвижностью; ее весовое содержание (в процентах от веса препарата) предложено использовать как количественный показатель для сравнения гидро-фобно-гидрофильных свойств различных гуминовых кислот.
ВВЕДЕНИЕ
Гуминовые вещества (ГВ) - это природные гетерогенные соединения, составляющие основную часть устойчивого органического вещества в почвах, осадках и природных водах. Они образуются в ходе деструкции остатков биологического происхождения, важным этапом преобразования которых в ГВ является спонтанная полимеризация фе-нольных соединений с другими предшественниками: белками, таннинами, углеводами и др. [6, 14]. В результате, конечный продукт представляет собой полидисперсную смесь молекул, различающихся по структуре и химическому составу. В целом, ГВ состоят из ароматических колец и алифатических цепочек и содержат как полярные группировки (О-, К- и 8-содержащие функциональные группы), так и неполярные фрагменты, что придает им амфи-фильность, то есть способность проявлять как гидрофобные, так и гидрофильные свойства [3].
Исследование ГВ как полидисперсной смеси дает лишь общую информацию об их составе и свойствах. Основными характеристиками ГВ, обусловливающими их подвижность и взаимодействие с ионами металлов, минералами и органическими соединениями, являются относительная гидрофоб-ность, размер и заряд молекул. Изучение реакционной способности ГВ в природной среде, а также их эффективное промышленное применение невоз-
* Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 05-04-49279, Президента Российской Федерации МК-5336.2007.4 и Фонда поддержки отечественной науки.
можно без предварительного фракционирования на основе этих признаков. Наиболее часто используется разделение ГВ на низкомолекулярные гидрофильные фульвокислоты и более высокомолекулярные гидрофобные гуминовые кислоты (ГК) путем подкисления раствора ГВ до рН < 2. Такой метод фракционирования далек от совершенства, поскольку фракция ГК остается высоко полидисперсной и гетерогенной. С целью получения гомогенных по контролируемым признакам фракций ГК применяют различные методы: гель-фильтрацию и мембранную фильтрацию - для разделения молекул по их размеру и геометрии; гидрофобную хроматографию - для разделения молекул по их способности вступать в гидрофобные взаимодействия; ионообменную хроматографию и электрофорез - для разделения по плотности и величине заряда [12]. Несмотря на то, что эти методы фракционирования позволяют получить более полную информацию о структурной организации ГК и выделить функционально однородные фракции, использование большинства из них в препаративных целях достаточно трудоемко.
В ранних работах для препаративного разделения и очистки ГК применялся метод высаливания возрастающей концентрацией соли [5, 7, 8, 15]. Метод заимствован из биохимии, где он применяется для очистки и фракционирования белков [10]. Эффект высаливания в большой степени зависит от свойств поверхности разделяемых молекул, то есть от плотности распределения полярных гидрофильных группировок (функциональных групп) и непо-
лярных гидрофобных фрагментов (алифатических цепочек, ароматических колец и др.). Молекулы, содержащие большое количество гидрофобных участков на поверхности, осаждаются первыми при низких концентрациях соли, тогда как молекулы с низким содержанием гидрофобных участков остаются в растворе даже при очень высоких концентрациях соли. Как правило, белки, осаждающиеся при низких степенях насыщения, являются наиболее полимерными. Результаты наших исследований показали, что это может быть справедливо и для почвенных ГК [17]. Таким образом, высаливание потенциально может применяться для разделения ГК не только по гидрофобно-гидрофильным признакам, но и по размеру молекул. Высаливание имеет ряд преимуществ перед хроматографическим разделением как общедоступный, дешевый и достаточно быстрый метод. Однако, из-за возможного соосаждения компонентов с различными амфи-фильными свойствами, а также различного размера, требуются независимые методы для проверки однородности выделенных фракций. Это ограничивает применение высаливания в химии гумуса.
Цель данной работы - изучить возможность применения высаливания для фракционирования ГК различного происхождения по их относительной гидрофобности, размеру и заряду, а также выявить условия разделения, позволяющие получать относительно однородные по выбранному признаку фракции ГК.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали ГК, выделенные из торфа (ГКТ, препарат фирмы "Merck"), дерново-подзолистой почвы (ГКД) и чернозема (ГКЧ). Выделение, очистка и физико-химические свойства препаратов описаны ранее [16]. Гуминовые кислоты
переводили в водорастворимую NH+ -форму путем растворения препаратов в 10%-ном растворе NH4OH с последующим высушиванием на водяной бане при температуре 40°C.
Фракционирование ГК проводили при рН 7 и концентрации исходного раствора ГК 5 мг/мл. Количество сульфата аммония (г/л), необходимое для получения раствора с насыщением S2 из раствора с насыщением S1, рассчитывали по формуле [10]:
(NH4)2SO4 (г/л) = 533 (S2-S1)/(100-0,3S2).
Сульфат аммония добавляли с шагом 10% насыщения. Образующийся через 2 ч осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Осадки промывали дистиллированной водой для удаления избытка сульфата аммония, переводили в NH+ -форму и высушивали при температуре 40°C. Компоненты ГК, оставшиеся в растворе при 60 или 70% насыщения, осаждали концентриро-
ванной HCl, промывали на центрифуге до нейтральной реакции надосадочной жидкости, переводили в
NH+ -форму и высушивали при температуре 40°C.
Распределение гидрофобных и гидрофильных фрагментов в пробах ГК и их фракций, полученных с помошью высаливания, было изучено на колонке 1 х 10 см (Amicon), заполненной гелем octyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Швеция). Стартовым буфером служил 0.05 M Трис-HCl (pH 7.2) с добавлением 10% сульфата аммония, что увеличивало эффективность гидрофобного связывания ГК с матрицей геля [5]. В колонку вносили 0.2 мг/мл ГК, растворенных в стартовом буфере. Элюирование ГК, сорбированных гидрофобной матрицей, осу-шествляли сначала 0.05 M Трис-HCl буфером (pH 7.2) при отрицательном линейном градиенте концентрации сульфата аммония, а потом при воз-растаюшей (до 0.3%) концентрации додецилсуль-фата натрия (ДДС-Na) в буфере. Ранее показано, что использование 0.3% ДДС-Na позволяет полностью элюировать наиболее гидрофобные компоненты ГК [11]. Высокая концентрация сульфата аммония в стартовом буфере увеличивает эффективность гидрофобного связывания ГК с матрицей геля благодаря солевому эффекту [4, 9]. Градиенты растворов создавали с помошью установки Ultrograd 11300 (LKB, Швеция). Оптическую плотность элюата измеряли при 280 нм с помошью детектора Uvicord S-II (Pharmacia, Швеция).
Количественную оценку гидрофобно-гидро-фильных свойств ГК проводили на основе коэффициентов разделения в двухфазных водных полимерных системах при рН 5.0. Использовали двухфазную систему 7.5% декстран Т70 - 5% по-лиэтиленгликоль 15000 - H2O (декстран и полиэтиленгликоль фирмы Loba Chemie, Германия). Коэффициенты распределения ГК (Kd) рассчитывали как отношение оптических плотностей верхней (обогашенной полиэтилен-гликолем, более гидрофобной) и нижней фаз (более гидрофильной), измеренных при 465 нм.
Молекулярно-массовые распределения ГК и их фракций изучали с помошью гель-фильтрации, используя колонку 0.9 х 60 см, заполненную гелем Sephadex G-75 (Pharmacia, Швеция). Элюентом служил 0.025 М Трис-HCl (pH 8.2) с добавлением 0.05 M NaCl, 0.1% ДДС-Na и 0.02% NaN3, скорость элюиро-вания составляла 8 мл/ч. Молекулярные массы полученных фракций рассчитывали по формуле Де-термана для глобулярных белков [2], процентное содержание фракций определяли по плошадям их хроматографических пиков. Средневзвешенные молекулярные массы рассчитывали, как описано в работе [13].
Электрофоретическую подвижность ГКД и ее фракций определяли на основе данных капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). Для исследований использовали систему капиллярного электро-
100 г
л
&80
л
к
щ
&
к
л
о
Щ
я н о
60-
£ СО
к м
л *
&
щ
и о
О
40-
20-
□ /
Ш/ 0///
и/У ■ V
гкт
гкд
гкч
Рис. 1. Весовое содержание фракций ГКД, выделенных высаливанием сульфатом аммония при насыщениях: I - 0-20% (ГКТ, ГКЧ), 0-40% (ГКД); II - 20-30% (ГКТ, ГКЧ), 40-50% (ГКД); III - 30-40% (ГКТ, ГКЧ), 50-60% (ГКД); IV - 40-60% (ГКТ, ГКЧ), 60-70% (ГКД); V - >60% (ГКТ, ГКЧ), >70% (ГКД). Номера фракций соответствуют порядку их осаждения (уменьшения относительной гидрофобности).
фореза "Капель-105" (Люмэкс, Санкт-Петербург) с наколоночным УФ-детектором и немодифициро-ванные кварцевые капилляры с внутренним диаметром 75 мкм, внешним диаметром 360 мкм, общей длиной 60 см и длиной до детектора 50 см. Разделение проводили при напряженности электрического поля 330 В/см и длине волны 254 нм. Пробы вводили гидродинамически в течение 5 с при давле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.