Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2007, том 33, № 1, с. 167-171
БИОХИМИЧЕСКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 582.282.23.017.73:577.19:547.458.223.342'19
ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИДОВ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ДРОЖЖЕЙ Cryptococcus humicola
И Pseudozyma fusiformata
© 2007 г. Е. В. Кулаковская*#, Т. В. Кулаковская*, В. И. Голубев*, Ä. С. Шашков**,
Ä. Ä. Грачев**, Н. Э. Иифантьев**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
142290, Пущино, просп. Науки, 5;
**Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва
Поступила в редакцию 10.08.2006 г. Принята к печати 12.08.2006 г.
Целлобиозолипиды дрожжевых грибов Cryptococcus humwola и Pseudozyma fusiformata обладают сходной фунгицидной активностью по отношению к различным дрожжам, в том числе к возбудителям криптококкозов и кандидозов. Наибольшую чувствительность к этим препаратам проявляют базидиомицетные дрожжи, в частности возбудитель криптококкоза Filobasidiella neoformans, клетки которого почти полностью погибают после 30-минутной инкубации в растворе гликолипида при концентрации 0.02 мг / мл. Такой же эффект в отношении аскомицетных дрожжей, в том числе возбудителей кандидозов, достигается лишь при в 5-8 раз более высокой концентрации гликолипидов. Целлобиозолипид P. fusiformata, который в отличие от гликолипида Cr. humicola имеет гидроксика-проновую кислоту в качестве О-заместителя целлобиозы и дополнительную 15-гидроксигруппу в агликоне, более эффективно подавляет рост исследованных мицелиальных грибов по сравнению с целлобиозолипидом из Cr. humicola.
Ключевые слова: целлобиозолипиды; фунгициды; дрожжи; грибы Cryptococcus humicola, Pseudozyma fusiformata; криптококкоз; кандидоз.
ВВЕДЕНИЕ
Гликолипиды разных типов, такие, как манно-зилэритритлипиды, софоролипиды и целлобиозолипиды, секретируются дрожжеподобными грибами, в том числе представителями родов Candida, Geotrichum, Kurtzmanomyces, Pseudozyma и Ustilago [1-3]. В литературе распространено мнение о том, что эти соединения выполняют в первую очередь роль биосурфактантов, т.е. облегчают растворение и потребление клетками микроорганизмов органических гидрофобных веществ, присутствующих в среде [1-3]. В последние годы обнаружено, что эти гликолипиды обладают также и биологической активностью. Так, софоролипиды усиливают иммунный ответ [4], обладают спермицидной и противовирусной активностью [5], а целлобиозолипиды в растворах с рН 4-5 проявляют противогрибковый эффект, сравнимый с активностью таких известных препаратов, как нистатин [6-12].
# Автор для связи (факс: (495) 923-36-02; эл. почта: alla@ibpm. pushchino.ru).
Фуигицидиая активность чистых целлобиозо-липидов изучена лишь для ограниченного числа тест-культур. Во Всероссийской коллекции микроорганизмов имеются продуценты целлобиозо-липидов, различающихся по структуре. Так, Cr. humicola штамма 9-6 секретирует комплекс цел-лобиозолипидов [8], содержащих от одного до шести ацетильных остатка в качестве О-замести-телей в сахарном фрагменте, среди которых доминирует тетра-О-ацетилированный гликолипид (I), а штамм P. fusiformata ВКМ Y-2821 секретирует устилаговую кислоту В (II) [10], содержащую в качестве О-заместителей ацетильную и 3-гидрок-сигексаноильную группы. Устилаговые кислоты были ранее выделены из культуральной жидкости Ustilago maydis [13], однако характер их биологической активности не исследовался, лишь недавно была обнаружена их противогрибковая активность [10, 12].
В настоящей работе впервые проведено сравнительное исследование фунгицидной активности гликолипидов (I) и (II) по отношению к различным дрожжам и грибам, в том числе патогенным для человека и растений.
H3C
ги, \
H3C
CH,
-0-■о ио-
0H
6CH3
0H
2„C00H 0H
(I)
H0 0
H3C
о
о H0-0H
ri
У
0
0H
2, C00H 0H
(II)
Структура внеклеточных целлобиозолипидов из Cr. humicola (I) [8] и P. fusiformata (II) [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фунгицидную активность целлобиозолипидов (I) и (II) определяли по выживаемости тест-культур. Результаты, представленные в табл. 1 и 2, свидетельствуют о том, что оба препарата почти одинаково эффективны в отношении использованных видов дрожжей. Это позволяет предположить, что различие в строении О-ацильных заместителей и агликонов не имеет существенного значения для фунгицидного действия на указанные культуры.
Оба целлобиозолипида подавляли рост ряда видов, имеющих медицинское значение: C. albicans, C. glabrata, C. viswanathii, F. neoformans, Cl. lusitaniae. При этом наблюдалась более высокая эффективность целлобиозолипидов против базидиомицет-
ных дрожжей (Cryptococcus, Filobasidiella), чем против аскомицетных (Saccharomyces, Candida, Clavispora).
Известно, что целлобиозолипид Cr. humicola и устилаговая кислота В вызывают выход ATP из клеток тест-культур, что указывает на способность этих соединений увеличивать проницаемость плазматической мембраны [7, 10]. Выход ATP уже в первые 5 мин инкубации клеток с гли-колипидами составлял 75-80% от максимального. Минимальные эффективные концентрации, вызывающие выход ATP и гибель клеток, имели близкие значения в отношении одних и тех же тест-культур (табл. 3). Это подтверждает ранее высказанное предположение о том, что основной механизм фунгицидного действия данных соеди-
Таблица 1. Выживаемость клеток культур дрожжей при их инкубации в присутствии целлобиозолипида (I) Cr. ter-reus, штамм 9-6
Концентра-
Количество выживших клеток тест-культур, % от контроля
пида, мг/мл Cr. terreus F. neoformans C. viswanathii C. glabrata C. albicans Cl. lusitaniae S. cerevisiae
0 100 100 100 100 100 100 100
0.02 2 5 71 100 100 100 100
0.04 0 1 16 * * * *
0.08 0 0 10 * * * *
0.16 * * * 25 2 10 5
0.30 * * * 2 1 1 1
* Не определяли.
ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИДОВ Таблица 2. Выживаемость клеток культур дрожжей при действии устилаговой кислоты B (II)
Концентра- Количество выживших клеток тест-культур, % от контроля
ция гликоли-
пида, мг/мл Cr. terreus F. neoformans C. viswanathii C. glabrata C. albicans Cl. lusitaniae S. cerevisiae
0 100 100 100 100 100 100 100
0.01 4 27 46 100 100 100 100
0.02 2 16 40 * * * *
0.05 0 4 29 * * * *
0.10 0 0 3 43 21 4 14
0.20 0 0 1 30 2 1 5
0.30 * * * 23 1 1 3
* Не определяли.
Таблица 3. Минимальные концентрации целлобиозолипидов (мг/мл), при которых выживаемость клеток тест-культур не превышает 1% (А) и достигается максимальный выход ATP из клеток дрожжей (Б)
Целлоби- Cr. terreus C. albicans
озолипид А Б А Б
(I) 0.04 0.05 0.16 0.12
(II) 0.04 0.06 0.20 0.10
Таблица 4. Количество гликолипида (мг), которое приводит к появлению на чашках Петри зон подавления роста тест-культур диаметром 15-20 мм
Тест-культура Гликолипид
(I) (II)
Cr. terreus 0.05 0.02
F. neoformans 0.05 0.02
S. cerevisiae 0.3 0.12
C. albicans 0.2 0.08
нений на клетки дрожжей связан с их детергент-ным свойством, обеспечивающим нарушение целостности плазматической мембраны [8].
Оба гликолипида подавляли рост дрожжей на чашках Петри, причем для образования близких по размеру зон подавления роста базидиомицет-ных дрожжей, таких, как Cr. terreus и F. neoformans требовалось в 5-6 раз меньше гликолипида, чем при подавлении аскомицетных дрожжей Sac-charomyces cerevisiae и C. albicans (табл. 4).
Рост исследовавшихся нами грибов подавлялся устилаговой кислотой (II) более эффективно, чем гликолипидом (I) (рисунок). При воздействии 0.12 мг устилаговой кислоты (II) зоны подавления роста диаметром около 15 мм наблюдали для фитопатогенных грибов Phomopsis helianthi и Sclerotinia sclerotiorum, а также грибов Mortierella isabellina и Mucor mucedo. Отметим, что грибы Ph. helianthi и M. isabellina не проявили чувствительности к гликолипиду Cr. humicola при нанесении на тест-диск даже 0.5 мг этого соединения, а два других гриба при воздействии этого же количества данного гликолипида давали зоны отсутствия роста менее 10 мм. О нечувствительности ряда грибов к гликолипиду Cr. humicola при тестировании "культура против культуры" сообщалось ранее [6]. Напротив, устилаговые кислоты подавляли рост фитопатогенного гриба Phomop-
sis sp., хотя количественные данные авторы не приводят [12, 14].
Для выяснения взаимосвязи особенностей структуры гликолипидов (I) и (II) и их антимикоз-ной активности, а также причин более эффективного фунгицидного действия устилаговой кислоты (II) на грибные культуры по сравнению с гликолипидом (I) нами исследуются соответствующие дез-О-ацилированные производные и синтетические аналоги, содержащие различное количество гид-роксигрупп в агликоне и другие модификации. Результаты испытаний этих соединений будут опубликованы отдельно.
Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что внеклеточные целлобиозолипиды дрожжевых грибов представляют интерес в качестве перспективных фунгицидов для использования в сельском хозяйстве, медицине и ветеринарии.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Дрожжи - продуценты гликолипидов Cr. humicola 9-6 и P. fusiformata ВКМ Y-2821, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ), выращивали в жидкой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 10, (NH4)2SO4 - 1, дрожжевой экстракт - 0.5, MgSO4 ■ 7 H2O - 0.05, Na2HPO4 ■ 12 H2O -10.9, лимонную кислоту - 7.3, рН 4.0. Выращива-
Подавление роста фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum под действием гликолипида (I) из Cr. humicola (а) и устилаговой кислоты B (II) (•). Цифрами указано количество гликолипидов (мг), нанесенное на диски.
ние проводили в состоянии покоя при температуре около 24°С в течение 2-3 недель.
В качестве тест-культур использовали штаммы дрожжей Cr. terreus ВКМ Y-2253, S. cerevisiae ВКМ Y-1173, C. albicans JCM 1542 (Японская коллекция микроорганизмов), F. neoformans IGC 3957, Clavispora lusitaniae IGC 2705 (Коллекция института Гульбекяна, Португалия), C. glabrata CBS 138 и C. viswanathii CBS 4024 (Центральная коллекция чистых культур грибов, Нидерланды), фитопатогенные грибы Ph. helianthi и Sclerotinia sclerotiorum, а также грибы M. isabellina ВКМ F-526 и M. mucedo ВКМ F-1355. Выращивание культур проводил
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.