научная статья по теме ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГЛИКОЛИПИДА SYMPODIOMYCOPSIS PAPHIOPEDILI SUGIYAMA ET AL Биология

Текст научной статьи на тему «ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГЛИКОЛИПИДА SYMPODIOMYCOPSIS PAPHIOPEDILI SUGIYAMA ET AL»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 841-845

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 582.282.23.017.73:577.152

ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГЛИКОЛИПИДА ЗУМРООЮМУСОРЗК РАРИЮРЕБШ 8и01УАМА ЕТ АЬ.

© 2004 г. В. И. Голубев*, Т. В. Кулаковская*, Е. В. Кулаковская*, Н. В. Голубев**

*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва Поступила в редакцию 23.12.03 г.

Дрожжи Sympodiomycopsis paphюpedШ (Ustilaginomycetes) секретируют гликолипид, обладающий наибольшим фунгицидным действием при значениях рН среды 4.0-4.5. Среди обследованных около 300 видов дрожжеподобных и мицелиальных грибов к нему чувствительны более 80%, в том числе патогенные для растений, животных и человека.

Ключевые слова: гликолипид, фунгицид, антагонизм, дрожжи.

Образование внеклеточных гликолипидов дрожжевыми и мицелиальными грибами родов Candida, Rhodotorula, Shizonella, Ustilago, Yarrowia известно достаточно давно. В функциональном плане они рассматриваются почти исключительно в качестве сурфактантов, обеспечивающих поглощение клетками микроорганизмов гидрофобных соединений [1-3]. Недавно, однако, обнаружено, что секретируемые гликолипиды Pseudozyma fusiformata [4], Ps. flocculosa [5] и Cryptococcus hu-micola [6] обладают фунгицидным действием против широкого спектра дрожжеподобных грибов, в том числе патогенных для человека, животных или растений. Эта активность, проявляющаяся при кислых значениях рН среды, обусловлена нарушением под действием гликолипидов проницаемости цитоплазматической мембраны [6, 7].

В ходе исследований антагонистических взаимоотношений между дрожжевыми грибами головневого аффинитета [4, 8, 9] антифунгальная активность обнаружена нами у представителя рода Sympodiomycopsis Sugiyama et al., Symp. paphiopedili [10]. Условия проявления этой активности, природа фунгицидного агента, спектр чувствительных к нему организмов охарактеризованы в настоящей работе.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы штаммы Всероссийской (ВКМ, http://www.vkm.ru), Японской (JCM, http://www.jcm.riken.go.jp) коллекций микроорганизмов, коллекций департамента микробиологии фармацевтического колледжа (Танаши, Япония) и института масличных культур (г. Краснодар). Чувствительность их к секретируемому Sympodiomycopsis paphiopedili ВКМ Y-2817 агенту тестировали методом "культура против культуры" (рис. 1)

на глюкозо (0.5%)-пептонном (0.25%) агаре (ГПА) с дрожжевым экстрактом (0.2%), глицерином (50 мл/л), сукцинат-натриевым буфером (рН 4) и инкубацией при 17°С При тестировании дрожжей рода Malassezia в среду добавляли оливковое масло (10 мл/л).

Для получения антифунгального препарата штамм BKM Y-2817 выращивали четыре недели в

Рис. 1. Подавление роста возбудителя белой гнили Sclerotinia sclerotiorum культурой Sympodiomycopsis paphiopedili ВКМ Y-2817 на ГПА (рН 4) с 0.003% ме-тиленового синего.

покое при комнатной температуре (20-24°C) в за-буференной сукцинат-натриевым буфером (рН 4) cpefle, содержащей 1% глюкозы, 0.1% (NH4)2SO4, 0.05% дрожжевого экстракта и 0.005% MgSO4. Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 30 мин, 0°C), супернатант после фильтрования через фильтр GF/A ("Whatman", Англия) лиофи-лизировали и из полученного порошка антифун-гальный агент в течение суток экстрагировали метанолом. После фильтрования экстракт почти досуха упаривали на роторном испарителе (40-50°C), добавляли 200 мл деионизованной воды и на ночь оставляли при 4°C. Выпавший осадок отделяли центрифугированием (4000 g, 15 мин, 0°C) и промывали два раза водой при тех же условиях центрифугирования. Осадок растворяли в метаноле и хроматографировали на колонке (25 х 1.5 см) с LH-Ceфадeкcом ("Pharmacia", Швеция), элюируя метанолом (скорость протока - 15 мл/ч, объем фракции - 4 мл). Для выявления активности во фракциях 10 мкл аликвоты наносили на фильтры GF/A (диаметр 5 мм), высушивали и помещали на ГПА (рН 4), засеянный газоном Cryptococcus ter-reus BKM Y-2253. Дальнейшую очистку фракций с наибольшей антифунгальной активностью проводили с помощью хроматографии на пластинках силикагеля HP-KF ("Whatman", США) в системе хлороформ-метанол-вода (4 : 4 : 0.2). Пробные хро-матограммы проявляли 5% раствором H2SO4 в этаноле при 100°C, а из соответствующей зоны с параллельных хроматограмм антифунгальное вещество экстрагировали метанолом и хранили при 4°C.

Полученный препарат высушивали в токе азота и подвергали гидролизу при 100°C для определения аминокислот 6 N HCl (6 ч) и сахаров 3 М трифторуксусной кислотой (0.5, 3 и 6 ч). Как сам препарат до гидролиза, так и гидролизаты его анализировали на аминокислотном ААА-881 ("Microtechna", Чехия) и углеводном ("Biotronic", Германия) анализаторах. XH ЯМР-спектр препарата получен в дейтерированном метаноле на спектрометре WH-400 Bruckner (Германия).

Оценку жизнеспособности клеток дрожжей при инкубации с очищенным препаратом осуществляли путем высева их суспензий на сусло-агар.

В целях элиминации антибиотического фенотипа культуру ВКМ Y-2817 инкубировали при 30°C, температуре близкой к максимальной для ее роста на сусле-агаре (32°C).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Антифунгальная активность Symp. paphiopedili BKM Y-2817 проявлялась в пределах значений рН среды от 3.5 до 5.0, причем она низка при крайних значениях этого диапазона и отсутствовала при рН 5.5 и выше. Наиболее широкие зоны подавления роста наблюдались при рН 4.0-4.5. После рас-

сева культуры BKM Y-2817, выращенной при 30°C, на активность проверено около 300 случайно выбранных колоний. Среди них не обнаружено ни одной утратившей антифунгальную активность.

С использованием ГПА (рН 4) на чувствительность к секретируемому штаммом BKM Y-2817 агенту обследованы 464 штамма дрожжеподоб-ных и мицелиальных грибов, принадлежащих к 301 виду 86 родов. 84% из проверенных видов были к нему чувствительны (таблица). Устойчивы к нему оказались виды 11 родов: Ambrosiozyma (4, 4), Atractogloea (1, 1), Dacrymyces (1, 1), Entyloma (1, 1), Guepiniopsis (1, 1), Hanseniaspora (3, 4), Neovossia (2, 2), Platygloea (1, 1), Saccharomyces (14, 18), Sac-charomycodes (1, 6) и Yarrowia (1, 9) (здесь и далее в скобках указано количество обследованных, соответственно, видов и штаммов). Обычно, следует отметить, виды одного рода одинаковы по реакции к исследованному агенту. Неоднородность в этом отношении обнаружена, однако, в родах Ex-obasidium, Kluyveromyces, Pseudozyma, Schizosac-charomyces, Taphrina, Tilletiopsis и Ustilago. B отличие от большинства чувствительных к нему членов этих родов отдельные виды, такие как Ex. vaccinii (2), Ex. pachysporum (1), K. africanus (1), K. lactis (2), Ps. aphidis (1), Ps. prolifica (1), Rh. lar-yngis (1), Schiz. pombe (11), T. caerulescens (1), T. carnea (1), T. populi-salicis (1), T. purpurescens (1), T. sadebeckii (1), Til. albescens (2), U. cynodontis (2) и U. maydis (5) оказались устойчивы. Напротив, среди 20 штаммов 16 видов рода Saccharomyces, в основном резистентных, слабую чувствительность к внеклеточному агенту штамма BKM Y-2817 проявили виды Sacch. kluyveri (1) и Sacch. kunashiriensis (1).

При хроматографии полученного неочищенного препарата на колонке с LH-сефадексом основная антифунгальная активность была сосредоточена во фракции, элюируемой после актино-мицина D (молекулярная масса - 1255 Да), т.е. содержащей соединения с молекулярной массой около или менее 1000 Да. При тонкослойной хроматографии данной фракции в системе хлороформ-метанол-вода (4 : 4 : 0.2) выявлялось несколько пятен, из которых активностью обладало вещество с Rf 0.75. Повторная хроматография при разных соотношениях компонентов использованной системы собранного из такого пятна вещества давало уже лишь одно пятно. Выход его составлял от 20 до 50 мг из 1 л культуральной жидкости.

Полученный препарат хорошо растворялся в метаноле и пиридине, но был мало растворим в хлороформе и практически нерастворим в воде. Он не окрашивался нингидрином и не содержал свободных аминокислот, которые не обнаружены и в гидролизатах. XH ЯМР-спектр его содержал резонансные сигналы в областях 1.7-0.9, 2.0, 3.0-3.9 и 4.2-4.5 м.д., соответствующие протонам

Роды грибов, чувствительные к агенту, секретируемому Sympodiomycopsis рарЫорвйШ ВКМ У-2817

Agaricostilbum (1, 1) Gymnosporangium (1, 1) Schizosaccharomyces (2, 6)*

Arthroascus (1, 1) Holtermannia (1, 1) Sclerotinia (1, 1)

Arxula (1, 1) Issatchenkia (1, 1) Septobasidium (1, 1)

Bensingtonia (6, 6) ItersonШa (1, 2) Sorosporium (1, 1)

Bullera (11, 28) Kluyveromyces (4, 5) Sphacelotheca (1, 1)

Bulleromyces (1, 1) Kockovaella (1, 1) Sporidiobolus (4, 4)

Candida (3, 3) Kurtzmanomyces (1, 1) Sporisorium (2, 3)

Citeromyces (1, 1) Leucosporidium (2, 2) Sporobolomyces (24, 26)

Clavispora (1, 1) Lipomyces (2, 2) Stephanoascus (1, 1)

Cryptococcus (28, 37) Lodderomyces (1, 1) Sterigmatomyces (2, 3)

Cystofilobasidшm (3, 3) Malassezia (2, 2) Taphrina (6, 6)*

Debaryomyces (7, 9) Mastigobasidium (1, 1) Шletia (1, 1)

Dekkera (1, 1) Mastigomyces (1, 1) Шletiaria (1, 1)

Diaporthe (1, 1) Metschnikowia (4, 4) Шletiopsis (5, 6)*

Dioszegia (2, 9) Microbotryium (5, 7) Torulaspora (1, 1)

Dipodascus (1, 1) Mrakia (2, 4) Trichosporon (12, 13)

Endomyces (1, 1) Myxozyma (4, 4) Trimorphomyces (1, 1)

Endophyllum (1, 1) Nadsonia (1, 1) Tsuchiyaea (1, 1)

Erythrobasidium (1, 1) Pichia (1, 1) Udeniomyces (3, 12)

Exobasidium (4, 5) Protomyces (2, 2) (7, 7)*

Farysia (1, 1) Pseudozyma (3, 8)* Wickerhamia (1, 1)

Fellomyces (3, 3) Puccinia (1, 1) WШюpsis (1, 1)

Filobasidiella (1, 50) Rhodosporidium (4, 4) Xanthophyllomyces (1, 4)

Filobasidium (3, 3) Rhodotorula (37, 46)* Zygosaccharomyces (1, 1)

GшlUermondella (1, 1) Saturnispora (1, 1) Zygozyma (1, 1)

* Имеются устойчивые виды (см. в тексте), которые не входят в число указанных в таблице. В скобках указано, соответственно, количество обследованных видов и штаммов.

функциональных групп, присущих жирным кислотам и сахарам (^Нз-, ^Н3СО-, пиранозных циклов и ^Н, ^Н=СН-) (рис. 2). В гидролизатах же были идентифицированы глюкоза и целлоби-оза, п

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»