ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 448, № 5, с. 598-601
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В МОЗГЕ, МИОКАРДЕ И СЕМЕННИКАХ КРЫС С 8- И 18-МЕСЯЧНЫМ НЕОНАТАЛЬНЫМ ДИАБЕТОМ © 2013 г. К. В. Деркач, А. О. Шпаков, И. В. Мойсеюк, О. В. Чистякова
Представлено академиком Н.П. Весёлкиным 01.06.2012 г. Поступило 21.06.2012 г.
БО1: 10.7868/80869565213050253
Наиболее распространенными осложнениями длительно текущего сахарного диабета (СД) второго типа являются нейродегенеративные заболевания, а также дисфункции со стороны сердечнососудистой и репродуктивной систем [1, 2]. Однако если в случае СД первого типа эти осложнения возникают сравнительно быстро вследствие совместного влияния острого инсулинового дефицита и выраженной гипергликемии, то при СД второго типа, для которого основным патогенетическим фактором является резистентность тканей к инсулину, осложнения развиваются намного медленнее и их манифестация происходит значительно позднее. Для изучения этиологии и патогенеза осложнений СД второго типа требуются пролонгированные модели этого заболевания на животных. Нами предложена длительная, 18-месячная неонатальная модель СД второго типа на самцах крыс, близкая по ряду характеристик СД второго типа человека. Она более адекватна в сравнении с генетическими моделями этого заболевания, поскольку у мутантных животных с возрастом возникают нарушения, не характерные для обычных животных [3]. Для мониторинга патологических изменений в нервной, сердечно-сосудистой и репродуктивной системах при СД второго типа мы изучали функциональное состояние аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) в мозге, миокарде и семенниках диабетических животных. Ранее нами было показано, что нарушения в АЦСС являются одной из основных причин развития осложнений СД, причем степень выраженности этих нарушений положительно коррелирует с тяжестью и длительностью заболевания [4—8]. Базальную активность аденилатцик-лазы (АЦ) и ее регуляцию гормонами в тканях крыс с 18-месячным неонатальным СД сравнива-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской Академии наук, Санкт-Петербург
ли с таковыми у здоровых животных того же возраста (контроль), а также с 8-месячными диабетическими и контрольными крысами. Для исследования были выбраны гормоны, которые действуют на АЦ как стимулирующим (через Gä-белки), так и ингибирующим (через Gгбелки) способом, и являются важнейшими регуляторами функций нервной, сердечно-сосудистой и репродуктивной систем.
Изучали две группы самцов крыс породы Wis-tar возраста 18 мес — с неонатальным СД (n = 7, масса тела 377 ± 17 г, уровень глюкозы в крови 6.0 ± 0.3 мМ) и контрольные (n = 7.315 ± 14 г, 4.2 ± ± 0.2 мМ), а также взятые для сравнения две группы самцов крыс возраста 8 мес — с неонатальным СД (n = 10, масса тела 312 ± 19 г, уровень глюкозы в крови 6.7 ± 0.9 мМ) и контрольные (n = 10, 264 ± ± 15 г, 4.7 ± 0.2 мМ). Неонатальный СД вызывали интраперитонеальным введением 5-дневным крысятам стрептозотоцина ("Sigma", США) в дозе 80 мг/кг, как описано ранее [5]. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Уровень глюкозы в цельной крови, взятой под местным наркозом из вены хвоста, измеряли с помощью тестовых полосок One Touch Ultra (США) и глюкометра (Ortho-Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson, Великобритания).
В опытах использовали норадреналин, изо-протеренол, серотонин, питуитарный АЦ-акти-вирующий полипептид-38 (PACAP-38), хориониче-ский гонадотропин человека (ХГЧ) соматостатин, форсколин ("Sigma", США), 5-нонилокситрипта-мин (5-НОТ) и 5-хлор-2-метил-3-(1,2,3,6-тетра-гидро-4-пиридинил)-1Н-индол (EMD-386088) "Tocris Cookson Ltd.", Великобритания). Релак-син-2 был любезно предоставлен профессором J. Wade (Университет Мельбурна, Австралия). Для определения активности АЦ использовали [а-32Р]АТФ (1000 Ки/ммоль) производства ОАО "Институт реакторных материалов" (Россия).
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
599
Выделение фракций плазматических мембран из тканей мозга (кора больших полушарий, стри-атум, гиппокамп), миокарда и семенников крыс и определение в них активности АЦ проводили, как описано ранее [9, 10]. Инкубацию мембран проводили при 37°С в течение 10 мин. Активность АЦ оценивали по количеству цАМФ, который получался в результате ферментативной реакции, и выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг мембранного белка. Статистический анализ данных проводили с использованием программы ANO-УЛ. Данные представлены в виде М ± ББ из трех независимых экспериментов. Различия оценивали как достоверные при Р < 0.05.
Базальная активность АЦ в мозге, миокарде и семенниках контрольных 18-месячных крыс была достоверно ниже таковой у 8-месячных контрольных крыс (табл. 1). У крыс с обоими сроками СД базальная активность фермента достоверно снижалась только в семенниках. Во всех изученных тканях базальная активность АЦ у 18-месячных диабетических крыс была существенно ниже, чем у восьмимесячных диабетических животных. Эти данные указывают на то, что как у контрольных, так и диабетических животных при увеличении возраста с 8 до 18 мес в мозге, миокарде и семенниках базальная активность АЦ в значительной степени снижается. Влияние на нее неонатально-го СД выражено слабо: базальная активность АЦ существенно снижается только в семенниках диабетических крыс.
Исследование стимулирующих АЦ-эффектов гормонов, действующих через О^-белки, показало, что в миокарде и семенниках наблюдаются значительные их изменения как при увеличении возраста животных, так и вследствие развития у них СД (рис. 1). В диабетическом миокарде 8-месячных крыс АЦ-эффект изопротеренола, агони-ста Р-адренергических рецепторов ф-АР), повышался, у 18-месячных, напротив, ослаблялся в сравнении с соответствующими группами контрольных животных. Этот эффект снижался на 28% также при увеличении возраста контрольных крыс с 8 до 18 мес. В случае норадреналина, неселективного агониста АР, наблюдалось значительное ослабление его АЦ-эффекта у 18-месячных крыс в сравнении с 8-месячными животными, причем при СД он был на 34% ниже, чем в контроле. АЦ-эффект релаксина в миокарде при СД также был снижен — у 18-месячных диабетических крыс он составил 46% от такового в контроле (рис. 1б). Полученные данные указывают на выраженные возрастные изменения функциональной активности, чувствительной к агонистам Р-АР и релаксину АЦСС в миокарде, и на нарушения, возникающие в этой системе в условиях длительно протекающего неонатального СД, что, как мы полагаем, приводит к осложнениям сердечно-сосудистой системы в условиях СД второго типа.
Таблица1. Базальная активность АЦ (пмоль цАМФ/мин • мг белка) во фракциях плазматических мембран, выделенных из тканей мозга, миокарда и семенников диабетических крыс с 8- и 18-месячным неонаталь-ным СД и контрольных крыс соответствующего возраста
Группа крыс, возраст, мес. Мозг Миокард Семенники
Контроль, 8 22.8 ± 1.3 25.2 ± 1.1 18.5 ± 1.0
Диабет, 8 21.7 ± 1.4 28.1 ± 0.9* 13.6 ± 1.1*
Контроль, 18 17.7 ± 1.2# 20.5 ± 1.1# 15.6 ± 0.9#
Диабет, 18 15.3 ± 1.9& 18.6 ± 2.0& 8.8 ± 0.3*&
* Различия между контрольными и диабетическими крысами одного возраста достоверны при Р < 0.05.
# Различия между контрольными (#) или диабетическими (&) крысами различного возраста достоверны при Р < 0.05.
Одними из причин ослабления чувствительности АЦ в диабетическом миокарде к агонистам Р-АР являются снижение плотности Р-АР и нарушения их сопряжения с О^-белками [4, 11].
В семенниках с увеличением возраста животных, а также в условиях неонатального СД наблюдалось значительное ослабление АЦ-эффекта ХГЧ, структурного и функционального аналога лютеинизирующего гормона, регулирующего синтез тестостерона клетками Лейдига. АЦ-эф-фект РАСАР-38, который вовлечен в процессы роста и регенерации тестикулярной ткани [12], снижался только в семенниках крыс с 18-месячным СД, слабо меняясь у других групп животных (рис. 1в). Выявленное нами снижение чувствительности АЦСС семенников к гонадотропинам и РАСАР-38, как мы полагаем, вызывает значительное ослабление функций мужской репродуктивной системы при СД второго типа, что приводит к гипогонадотропным состояниям и бесплодию [13, 14].
В мозге крыс с увеличением возраста наблюдалось значительное снижение АЦ-эффекта РАС-АР-38, играющего ключевую роль в регуляции роста и дифференцирования нейрональных и глиальных клеток [12], в то время как эффекты серотонина и агониста серотониновых рецепторов шестого типа ЕМЭ-386088, вовлеченных в контроль когнитивных функций, снижались в меньшей степени (рис. 1а). Неонатальный СД существенно не влиял на АЦ-эффекты изученных гормонов в мозге, за исключением некоторого снижения эффекта серотонина.
Далее исследовали ингибирующие АЦ-эффек-ты соматостатина во всех тканях, 5-НОТ, агониста серотониновых рецепторов 1В-подтипа, в мозге и норадреналина, агониста а/Р-АР, в миокарде (рис. 2). В диабетическом мозге в значительной степени менялся АЦ-эффект 5-НОТ, который в условиях 8-месячного СД снижался на 59%,
600
ДЕРКАЧ и др.
пмоль цАМФ/мин • мг белка 100 г
80
60
40
20
0 120 100 80 60 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0
&
I—I 1 □ 2 Е33
(а)
&
ш
#&
Серотонин ЕМБ-386088 РАСАР-38
(б)
* # X.
&
Изопротеренол Норадреналин Релаксин
(в)
* #
&
й
ХГЧ
РАСАР-38
Рис. 1. Прирост стимулированной гормонами активности АЦ к базальной активности фермента в тканях мозга (а), миокарде (б) и семенниках (в) диабетических крыс с 8- и 18-месячным неонатальным диабетом и контрольных крыс того же возраста. 1, 3 — контрольные крысы возраста 8 и 18 мес соответственно; 2, 4 — диабетические крысы возраста 8 и 18 мес соответственно. Различия между контрольными и диабетическими крысами одного возраста (звездочка), а также между контрольными (решетка) или диабетическими (значок) крысами различного возраста достоверны при Р < 0.05.
%
100 80 60 40 20
&
д
Рис. 2. Ингибирующий эффект гормонов на стимулированную форсколином активность аденилатцикла-зы в тканях диабетических и контрольных крыс различного возраста. а, в, д — сомат
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.